6-Phosphofructo-2-kinase/Fructose-2,6-bisphosphatase und chemische Glucokinase-Aktivatoren verändern die Enzymaktivität von Glucokinase CHI-Varianten über unterschiedliche Mechanismen

Fragestellung:

Das Enzym Glucokinase hat sowohl in β-Zellen als auch in Hepatozyten die Funktion des Glucosesensors inne und zeichnet sich durch eine hohe strukturelle Flexibilität aus. Pharmakologischen Strategien, die Enzymaktivität und damit den Blutglucosespiegel zu modulieren, steht ein unzureichendes Verständnis der intrazellulären Regulation des Enzyms entgegen.

Methodik:

Die kinetischen Eigenschaften der aktivierenden CHI-Mutationen S64Y und G68V wurden im Vergleich zur Wildtyp-Glucokinase untersucht. Zusätzlich wurden auch die chemischen Aktivatoren RO-28 – 1675 und Compound A, der endogene Aktivator Fructose-2,6-bisphosphatase, sowie der Inhibitor Mannoheptulose eingesetzt. Mittels in silico Protein-Protein-Dockings wurde eine mögliche Fructose-2,6-bisphosphatase-Bindungsregion innerhalb des Glucokinase-Moleküls ermittelt.

Ergebnisse:

Beide Mutationen liegen in der Verbindungsregion I der Glucokinase und erhöhen die Glucose-Affinität des Enzyms bei unveränderter thermischer Stabilität und intrazellulärer Lebensdauer. Die S64Y Mutation behindert die Ausbildung einer Turn-Struktur, welche charakteristisch für die inaktive Konformation des Enzyms ist. Compound A verursacht sterische Kollisionen von Tyr-64 mit der großen Glucokinase-Domäne. Dagegen führt die G68V Mutation zu Wechselwirkungen der Verbindungsregion I mit der C-terminalen α13-Helix, auch bei gleichzeitiger Bindung der chemischen Aktivatoren. Beide Mutanten wurden durch Fructose-2,6-bisphosphatase und RO-28 – 1675 zusätzlich aktiviert. Der Aktivator Compound A steigerte die G68V Aktivität, hemmte allerdings die S64Y Aktivität, was durch Mannoheptulose weiter verstärkt wurde. Der Interaktionspartner Fructose-2,6-bisphosphatase bindet mutmaßlich seitlich des katalytischen Spaltes der Glucokinase.

Schlussfolgerungen:

Aktivierende Glucokinase-Mutationen lassen die gleichzeitige Bindung allosterischer Aktivatoren zu. Interessanterweise können sie deren Wirkung jedoch zu einer Hemmung umkehren. Der ermittelte Glucokinase-Fructose-2,6-bisphosphatase-Komplex zeigt die Notwendigkeit des Substrat-Channelings auf, wodurch die Reaktionsgeschwindigkeit durch eine Begrenzung des Diffusionsraums erhöht wird, und eröffnet neue Ansatzpunkte für die Pharmakotherapie.