Z Gastroenterol 2019; 57(09): e309-e310
DOI: 10.1055/s-0039-1695430
Gastroenterologische Onkologie
Pankreaskarzinom: Molekular -Tumorgenese: Freitag, 04. Oktober 2019, 13:20 – 14:56, Studio Terrasse 2.2 A
Georg Thieme Verlag KG Stuttgart · New York

Gezielte genetische Modifikation von Treibergenen des duktalen Pankreasadenokarzinoms

M Felsenstein
1   Charité – Universitätsmedizin Berlin, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Berlin, Deutschland
,
M Skaro
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
N Nanda
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
M Pflueger
1   Charité – Universitätsmedizin Berlin, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Berlin, Deutschland
,
M Qiu
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
Z Jiang
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
M Noe
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
P Chianchiano
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
C Fisher
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
JL Camoron
3   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Surgery, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
C Wolfgang
3   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Surgery, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
M Bahra
1   Charité – Universitätsmedizin Berlin, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Berlin, Deutschland
,
I Sauer
1   Charité – Universitätsmedizin Berlin, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Berlin, Deutschland
,
J Pratschke
1   Charité – Universitätsmedizin Berlin, Allgemein- und Viszeralchirurgie, Berlin, Deutschland
,
M Goggins
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
R Hruban
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
NJ Roberts
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
,
LD Wood
2   Johns Hopkins University School of Medicine, Department of Pathology and Oncology, Baltimore, Vereinigte Staaten von Amerika
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Publication History

Publication Date:
13 August 2019 (online)

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    Einleitung:

    Das duktale Pankreasadenokarzinom (dPA) entwickelt sich aus Vorläuferläsionen auf oden einer definierten Abfolge genetischer Veränderungen (KRAS, CDKN2A, TP53, SMAD4). Der molekulare Mechanismus dieser Abfolge ist nicht endgültig geklärt. Es fehlen in vitro Modelle zur Untersuchung mechanistischer und molekularer Fragestellungen im dPA. Mithilfe der modernen CRISPR/Cas9 Technik können Gene gezielt verändert und die Mutationen im Einzelnen charakterisiert werden.

    Ziel:

    Die gezielte Einführung pankreatischer Treibermutationen in eine normale duktale Epithelzelllinie bildet die Basis neuer in vitro Modelle.

    Methodik:

    Als Empfängersystem wurde eine immortalisierte humane duktale Epithelzelllinie (HPDE) verwendet. Es wurden CRISPR/Cas9 Vektoren für die entsprechenden Zielsequenzen etabliert. Zur Modifikation des Onkogens KRAS wurde zudem eine Donor Oligonukleotidsequenz zur Anwendung des akkuraten Homology Directed Repair (HDR) entwickelt. Die Vektoren wurden über liposomale/lentivirale Transfektion in die Zellen eingeführt. Das T7E1 Assay validierte die Effektivität der Vektoren an den Zielsequenzen. Tiefensequenzierung wurde zur Identifizierung für die KRASG12D knock-in Sequenz verwendet, während SMAD4 knock-out Klone über Dilutionsreihen etabliert wurden.

    Ergebnis:

    Standardisierte Protokolle zur Vektorklonierung überführten gRNA Sequenzen in wtCas9 Plasmide. Die klonierten Plasmide wurden zur Transfektion der Zielzellen verwendet. Bereits nach 72h konnte effektives Non-Homology End-Joining (NHEJ) und HDR nachgewiesen werden. Im Anschluss einer GFP+ Zellsortierung wurden transfizierte Zellpoole über moderne Tiefensequenzierung untersucht. Zum Beispiel konnte der Einbau einer Single Nucleotide Variant an Kodon Position 12 (KRAS G12D) erfolgreich in 0,15% der Zellen nachgewiesen werden. Die fehlende Proteinexpression der SMAD4 knock-out Klone wurde über Immunoblotting bestätigt.

    Schlussfolgerung:

    Das moderne CRISPR/Cas9 Verfahren ermöglicht die Einführung gezielter genetischer Veränderungen. Diese ist akkurat, bedingt-effizient und ermöglicht die Entwicklung neuer in vitro Modelle. In Zukunft kann diese Technik in der Entwicklung neuer individualisierter Therapieansätze eine wesentliche Rolle spielen.


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