Das in-vitro-3D-Frakturspalt-Modell: Eine präklinische Test-Plattform

Einleitung Aufgrund der zunehmend älteren Bevölkerungsstruktur ist mit der Zunahme an Frakturheilungsstörungen (Prävalenz 10 %) zu rechnen. Gerade die initiale Phase der Frakturheilung ist entscheidend für eine erfolgreiche Frakturheilung. Diese Anfangsphase ist durch einwandernde Immunzellen und eine entzündliche Mikroumgebung charakterisiert. Die Grundlagenforschung sowie die translationale Forschung beruht zumeist auf Erkenntnissen aus Kleintiermodellen, die sich oft schwer auf den Menschen übertragen lassen. Um den Verlauf der Frakturheilung in der initialen Phase zu untersuchen und die Therapie von Frakturheilungsstörungen zu verbessern, haben wir ein humanzellbasiertes in-vitro-3D-Frakturspalt-Modell (FG-Modell) entwickelt.

Methode Zunächst wurde ein Frakturhämatom simuliert (FHs), wobei peripheres Blut und humane mesenchymale Stromazellen (MSCs) agglutiniert wurden. Das FG-Modell wurde durch Co-Kultivierung des FHs für 48 h unter hypoxischen Bedingungen (n = 3) mit einem trägerfreien knochenähnlichen Konstrukt erstellt. Um den Einfluss des knochenähnlichen Konstrukts auf das FHs hinsichtlich seiner osteogenen Induktionsfähigkeit zu analysieren, wurden die FG-Modelle in Medium ohne Supplementation kultiviert. Um den Einfluss von Deferoxamin (DFO) auf das FG-Modell zu analysieren, wurden die FG-Modelle in einem zusätzlichen Versuch mit 250 µmol DFO kultiviert. Anschließend wurde die Genexpression osteogener (RUNX2, SPP1), angiogener (VEGF, IL8), inflammatorischer Marker (IL6, IL8) und Marker für die zelluläre Anpassung an ein hypoxisches Milieu (LDHA, PGK1) sowie die Produktion von Zytokinen und Chemokinen mittels quantitativer PCR bzw. Multiplex-ELISA untersucht.

Ergebnisse Die histologische Analyse zeigte den engen Kontakt der beiden Modelle während der Kultivierung. Somit war die Zellinteraktion über den Austausch von Signalmolekülen und Metaboliten. Weiterhin zeigen die Ergebnisse der qPCR, dass die knochenähnlichen Konstrukte die osteogener Marker (RUNX2, SPP1) innerhalb der FHs hochregulieren. Weiterhin beobachteten wir unter dem Einfluss von DFO eine Steigerung der Expression der analysierten Hypoxie-adaptiven, pro-angiogenen und osteogenen Marker sowie eine Reduktion der Expression von Entzündungsmarkern (IL6, IL8) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Letzteres wurde auch auf Proteinebene bestätigt. Innerhalb der knochenähnlichen Konstrukte beobachteten wir eine verstärkte Expression der analysierten pro-angiogener Marker, die unter der Behandlung von DFO noch stärker ausgeprägt war.

Diskussion Zusammenfassend zeigen unsere Analysen, dass die Co-Kultivierung in unserem komplexen FG-Modell alle osteogenen Schlüsselmoleküle beisteuert, um den Knochenregenerationsprozess einzuleiten. Daher ist unser Modell in der Lage ist, die menschliche Frakturspaltsituation korrekt nachzuahmen und den Einfluss und die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika für die Behandlung von Knochenheilungsstörungen zu untersuchen.

Keywords in vitro Modell, Frakturheilung, BTE

Korrespondenzadresse Moritz Pfeiffenberger, Rheumatologie, Charite-Universitätsmedizin Berlin, Chariteplatz 1, 10117 Berlin, Deutschland

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Article published online:
05 March 2021