Z Gastroenterol 2009; 47 - P152
DOI: 10.1055/s-0029-1241402

Ein aminoterminal lokalisierter, basischer Leuzinzipper moduliert Protein-Proteininteraktionen des Nichtstrukturproteins 4B des Hepatitis C Virus

MW Welker 1, C Welsch 1, 2, A Meyer 3, N Forestier 1, B Kronenberger 1, T Lengauer 2, A Piiper 1, S Zeuzem 1, C Sarrazin 1
  • 1Klinikum der Johann Wolfgang Goethe Universität, Medizinische Klinik 1, Frankfurt, Germany
  • 2Max-Planck Institut für Informatik, Abteilung Bioinformatik und Angewandte Algorithmik, Saarbrücken, Germany
  • 3Universitätsklinikum des Saarlandes, Medizinische Klinik 2, Homburg, Germany

Einleitung: Das Nichtstrukturprotein 4B (NS4B) des Hepatitis C Virus (HCV) initiiert eine als „membranous web“ bezeichnete Alteration des Endoplasmatischen Retikulums, die als Korrelat des viralen Replikationskomplexes angesehen wird. Polymerisation von NS4B ist beschrieben; Einzelmutationen im NS4B sind im Replikonmodell mit einer verstärkten Replikation assoziiert. Über funktionelle Motive im NS4B ist wenig bekannt. In Vorarbeiten haben wir ein basisches Leuzinzippermotiv (bZIP) im aminoterminalen Teil des NS4B identifiziert. Ein bZIP ist ein Proteinstrukturmotiv, welches Protein-Proteininteraktionen vermittelt.

Ziele: Ziel war der experimentelle Nachweis des vorhergesagten bZIP-Motivs im HCV-NS4B sowie die Untersuchung eines eventuellen Einflusses dieses Motivs auf NS4B-Proteininteraktionen.

Methodik: Das komplette NS4B wurde mithilfe eines pcDNA3–1(-)-Vektors exprimiert. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden verschiedene Erkennungsmotive carboxyterminal implementiert. Basierend auf in-silico Sequenzanalysen erfolgten zielgerichtete Mutagenesen exponierter Positionen im bZIP-Motiv. Protein-Proteininteraktionen wurden mit Western-Blot und Ko-Immunpräzipitation (Ko-IP) untersucht. Vergleichende Strukturmodelle und molekulardynamische Simulationen wurden zur weiterführenden Analysen der Proteinstruktur angewandt.

Ergebnis: Eine Interaktion zwischen verschiedenen NS4B-Molekülen wurde nach Ko-Transfektion von HEK 293T-Zellen mittels Western-Blot und Ko-IP nachgewiesen. Diese Interaktion war nicht nachweisbar, wenn das bZIP-Motiv beider NS4B-Partner modifiziert war. Bei der Kombination von Wildtyp (WT) und mutierter Form (MF) war die Interaktion schwächer ausgeprägt. Die dreidimensionale Struktur eines bZIP NS4B Homodimers wurde modelliert und molekulare Mechanismen der Protein-Proteininteraktion analysiert. Die Kalkulation der Bindungsenergien zeigte eine Zunahme von 54,82kcal/mol (WT/WT) auf 650,83kcal/mol (MF/MF).

Schlussfolgerung: HCV-NS4B-Moleküle interagieren miteinander. Diese Interaktion hängt von einem intakten bZIP-Motiv ab. In-silico-Daten legen einen Homodimerisierung nahe. Die Bedeutung des bZIP-Motivs für die Ausbildung des membranous web und die Replikation wird in Folgeprojekten untersucht.