Z Gastroenterol 2009; 47 - P354
DOI: 10.1055/s-0029-1241602

Proteinkinase D2 interagiert mit alpha-SNAP und reguliert das SNARE-Komplex-Recycling in humanen neuroendokrinen Tumorzellen

U Lother 1, JL Eismann 1, G Adler 1, T Seufferlein 1, G von Wichert 1
  • 1Universität Ulm, Innere Medizin I, Ulm, Germany

Einleitung: Die Proteinkinase D2 (PKD2) agiert als wichtiger Regulator der neuroendokrinen Sekretion. Die Mechanismen, mit denen die PKD2 die Chromogranin A-Freisetzung in humanen neuroendokrinen Zellen im Detail reguliert, sind bisher weitgehend unbekannt und sollen in der vorliegenden Studie in BON-Zellen untersucht werden. PKD2 beeinflusst die Freisetzung von Vesikeln aus dem Trans-Golgi-Netzwerk. Die Fusion von Vesikeln mit der Ziel-Membran wird durch die SNARE-Proteine vermittelt, deren trimere Komplexe die treibende Kraft des Membranfusionsprozesses sind. Der anschließend notwendige Recycling-Prozess wird durch einen Proteinkomplex bewerkstelligt, der u.a. die ATPase NSF und das Chaperon alpha-SNAP enthält.

Ziel: Identifikation von neuen Interaktionspartnern von PKD2 und Charakterisierung der Interaktion und Funktion in der Exozytose von Chromogranin A.

Methodik: Screening auf mögliche Interaktionspartner von PKD2 mittels eines bakteriellen Two-Hybrid-Assays. Biochemische (Koimmunopräzipitation) und fluoreszenzmikroskopische Bestätigung der Interaktion. Charaktersieirung der Interaktion über GFP-markierte PKD2-Deletionsmutanten. Funktionelle Charakterisierung in biochemischen und zellbiologischen Assays.

Ergebnis: Im Two-Hybrid-Assay konnte alpha-SNAP als Interaktionspartner von PKD2 identifiziert werden. Anschließend konnte die Interaktion in Koimmunpräzipitationen mit alpha-SNAP und PKD2 in humanen neuroendokrinen BON-Zellen bestätigt werden. Durch Verwendung GFP-markierter PKD2-Deletionsmutanten konnten wir die Kinasedomäne der PKD2 als Bindungsstelle für alpha-SNAP biochemisch und fluoreszenzmikroskopisch charakterisieren. Interessanterweise ist alpha-SNAP in Kinase-Assays kein direktes Substrat von PKD2. Dennoch ist PKD2 ein potenter Regulator der Auflösung von SNARE-Komplexen. Nach siRNA-Knockdown von PKD2 und alpha-SNAP nimmt die Menge an Syntaxin/SNAP25– Komplexen in der Koimmunpräzipitation zu.

Schlussfolgerung: PKD2 ist ein potenter Regulator neuroendokriner Sekretion und durch eine Interaktion mit alpha-SNAP an der Regulation des Recyclings von SNARE-Komplexen beteiligt.