Applikation der retroviralen Insertionsmutagenese zur Identifikation relevanter molekularer Mechanismen in der humanen Hepatokarzinogenese

Hintergrund: Die molekulare Pathogenese des HCC ist bisher nicht vollständig verstanden. Eine Stabilisierung der Telomere stellt eine notwendige, jedoch nicht hinreichende Voraussetzung für eine maligne Transformation humaner Hepatozyten dar. Zur Identifizierung weiterer für die mehrstufige Hepatokarzinogenese relevanter Veränderungen haben wir in Telomerase-immortalisierten humanen fetalen Hepatozyten (FH-hTERT) mittels retroviraler Insertionsmutagenese (prä-) maligne Phänotypen induziert. Methoden: FH-hTERT wurden als Modellsystem für nicht-transformierte Hepatozyten verwendet und mit replikationsinkompetenten γ-Retroviren mit GFP als Markerprotein (SF11αEGFPrev) transduziert. Um Zellklone mit verändertem Phänotyp zu isolieren, wurden 50% transduzierte GFP-positive Zellen und 50% Kontrollzellen gemischt und bei einer wiederholten Passage von 1: 6 kultiviert. Mittels LM-PCR und qRT-PCR wurden die Insertionen der einzelnen Klone identifiziert, funktionell charakterisiert und zu den phänotypischen Veränderungen in Beziehung gesetzt. Ergebnisse: In den Mischkulturen zeigte sich nach 80 Tagen eine oligoklonale Dominanz GFP-positiver Zellen (90,8±4,1%) mit Reduktion der GFP-Streuung. Drei abgeleitete Einzelzellklone (K4, K6, K9) zeigten eine neu aufgetretene Koloniebildung im Softagar (200–900 Kolonien je 5000 Zellen). Mittels LM-PCR wurde für K4 eine Insertion in der Nähe von RIPK4 (receptor-interacting serine-threonine kinase 4, 21q22.3, TSS -150 kb) mit konsekutiver 10-facher Suppression der Expression von RIPK4 identifiziert. Eine auf 5–10% erniedrigte Expression von RIPK4 wurde auch in HCC-Proben im Vergleich zu gesundem Lebergewebe nachgewiesen. Zusammenfassung: Mittels retroviraler Insertionsmutagenese können genetische Veränderungen ausgelöst werden, die in FH-hTERT eine maligne Transformation propagieren. Mit dieser Technik können bisher nicht bekannte Signalwege (z.B. RIPK4) für die humane Hepatokarzinogenese identifiziert und untersucht werden.

Hepatokarzinogenese - Insertionsmutagenese - Telomerase