A New Photometric Assay with Bromocresol Purple for Testing in vitro Antitrichomonal Activity in Aerobic Environment

Summary

A new colorimetric assay relying on the acidic metabolism of Trichomonas vaginalis was developed for in vitro screening of various compounds against axenically grown trichomonads. Parasites from continuous culture were exposed to series of drug dilutions in a microtiter plate. After an incubation period of 48 h at 37 °C, the pH indicator of the medium had changed its colour in non-inhibited cultures due to the production of lactate and acetate. Inhibited cultures showed no colour changes. The use of bromocresol purple, a pH indicator, was suitable for several reasons: it is not toxic at the concentration used in the assay; the absorbance of bromocresol purple at 405 nm showed a linear correlation with both the pH of the medium and the viability of the trichomonads observed microscopically; plates could easily be read by eye or using an enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) reader. By comparison of the decreases in absorbance in test cultures with those in control cultures, IC₅₀ values could be determined. Thus, IC₅₀ of metronidazole was calculated at 25.5 ± 2.3 µmol/l (n = 5) with the bromocresol purple assay and about 25 µmol/l after microscope observation. Minimal lethal concentrations (MLCs) could be read by eye. This test is now routinely used for antitrichomonas evaluation of various chemical compounds and natural products.

Zusammenfassung

Neue photometrische Methode mit Bromkresolpurpur zum Nachweis antitrichomonaler Aktivität unter aeroben Bedingungen in vitro

Es wurde eine neue kolorimetrische Bestimmungsmethode zum In-vitro-Screening verschiedener Substanzen gegen axenische Kulturen von Trichomonaden auf der Grundlage saurer Metaboliten von Trichomonas vaginalis entwickelt. Parasiten aus Dauerkulturen wurden auf einer Mikrotiterplatte ansteigenden Konzentrationen der Substanzen ausgesetzt. Nach 48 h Inkubationszeit bei 37 °C hatte in nichtinhibierten Kulturen die Produktion von Laktat und Azetat den pH-Indikator des Mediums zum Umschlag gebracht. In Gegenwart eines Inhibitors änderte sich die Farbe dagegen nicht. Die Verwendung von Bromkresolpurpur als pH-Indikator wird aus folgenden Gründen vorgeschlagen: die Substanz gilt in den hier verwendeten Konzentrationen als nicht toxisch; weiterhin war eine lineare Beziehung zwischen der Extinktion von Bromkresolpurpur bei 405 nm sowohl im Hinblick auf den pH-Wert des Milieus als auch der mikroskopisch beobachteten Lebensfähigkeit der Trichomonaden zu beobachten, und schließlich können die Platten leicht visuell oder mit einem ELISA-Analysator ausgewertet werden. Die IC₅₀-Werte können durch Vergleich der Abnahme der Extinktion der Testund Vergleichskulturen bestimmt werden. Die IC₅₀ von Metronidazol wurde auf diese Art mit der Bromkresolpurpur-Methode zu 25,5 ±_ 2,3 µmol/l (n = 5) und durch mikroskopisches Auszählen zu etwa 25 µmol/l bestimmt. Die minimalen lethalen Konzentrationen (MLC) können visuell bestimmt werden. Die beschriebene Screeningmethode wird gegenwärtig zur Bewertung der antitrichomonalen Wirkung verschiedener synthetischer und natürlicherSubstanzen eingesetzt.

Key words

Bromocresol purple - CAS 443-48-l - Metronidazole - Trichomonas vaginalis, anti-trichomonas evaluation, screening assay