CRISPR-Cas9 induzierter Knock-out des endogenen Retrovirus Erv3 in der humanen Chorionkarzinomzelllinie Jeg-3

Zielsetzung: Die bakterielle CRISPR-associated protein 9 Nuklease (Cas9) aus Streptococcus pyogenes ist eine Caspase, welche zielgerichtet genomische DNA-Stränge schneiden kann. Sie wird eingesetzt, um DNA-Abschnitte zu modifizieren. Die Nuklease wird durch die Expression einer guidedRNA (gRNA) zur Ziel-DNA Sequenz geführt und induziert dort Einzel- oder Doppelstrangbrüche. Ziel dieses Projektes war ein Knockout des humanen endogenen Retrovirus Erv3 mittels CRISPR-Cas9 induzierter Deletion in der Chorionkarzinomzelllinie Jeg-3.

Materialien und Methoden: Für die Klonierung der CRISPR-Cas9 Vektoren wurde die entsprechende gRNA unter Verwendung des CRISPR Design Tools entworfen. Die gRNA wurde in den pSpCas9(BB)-2A-GFP Vektor kloniert. Nach der Transfektion des Konstrukts in die Chorionkarzinomzelllinie Jeg-3 wurden anschließend Einzelzellklone über Fluoreszenz-activated-Cellsorting isoliert. Induzierte Mutationen im Erv3 Gen wurden mittels Sequenzierung detektiert. Western Blot Analysen wurden zum Protein-Nachweis genutzt.

Ergebnisse: Mittels CRISPR-Cas9 induzierter Mutation konnten in insgesamt sieben Jeg-3 Klonen unterschiedliche Mutationen im Erv3 Genom erzeugt werden. Wir konnten Deletionen von 1 – 186 Nukleotiden, sowie eine heterozygote Punktmutation induzieren. In zwei Klonen wurde durch die Deletion ein Frameshift erzeugt, welcher zum Verlust des Erv3 Proteins führte.

Abb. 1: CRISPR-Cas9

Zusammenfassung: CRISPR-Cas9 ist eine Methode, welche eine zielgerichtete Mutation der DNA ermöglicht. Wir konnten in diesem Projekt mittels induzierter Deletion erfolgreich die Expression des humanen endogenen Retrovirus Erv3 ausschalten.