In vitro Modell für endochondrale Ossifikation

Einleitung:

Der am häufigsten genutzte Ansatz zur Herstellung artifiziellen Knochens ist die Besiedelung diverser Trägermaterialien (anorganisches Grundgerüst) mit Knochenvorläufer- oder Knochenzellen (häufig primäre mesenchymale Stromazellen bzw. Osteoblasten, Osteozyten). Die Trägermaterialien kommen zum Einsatz, um den Zellen ein optimales Gerüst zur Zellbesiedelung und -proliferation zu bieten und die Zelldifferenzierung positiv zu beeinflussen. Um den menschlichen Knochen in Struktur und Charakteristik abzubilden, haben wir zusammen mit unserem Kooperationspartnern des Forschungszentrums für Medizintechnik und Biotechnologie (Bad Langensalza) knochenähnliche Modelle hergestellt und charakterisiert, die ausschließlich aus humanen mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und deren Matrix bestehen.

Methode:

Dazu wurden MSCs aus Knochenmarkproben von Patienten nach Hüftoperation isoliert und anschließend hinsichtlich ihrer typischen Oberflächenmarker (CD73+, CD90+, CD105+, CD14-, CD20-, CD34-, CD45-) mittels Durchflusszytometrie und Differenzierungspotenzial jeweils in die osteogene (Alizarin-Rotfärbung), chondrogene (Toluidin-Blaufärbung) bzw. adipogene (Red-Oil-Färbung) Linie charakterisiert. Anschließend wurden die 3D-Knochenmodelle nach einem patentierten Verfahren von unserem Kooperationspartner hergestellt. Die Herstellung und Reifung dieser 3D-Knochenmodelle dauerte bis zu einem Monat (Tag 0), bevor sie unter hypoxischen Bedingungen (37 °C, 5% CO2, 1% O2) bis zu zwei Monate lang in osteogenem Medium weiter kultiviert wurden. Die zunehmende Kalzifizierung und knochenähnliche Charakteristik wurde mittels in vitro µCt Analyse, histologischen sowie immunhistochemischen Untersuchungen und der Analyse relevanter Marker auf mRNA-Ebene evaluiert.

Ergebnisse:

Die 3D-Knochenmodelle erreichten Durchmesser zwischen 0,5 und 0,7 cm, eine Dicke von 0,3 cm und waren in ihrer Größe und Form sowie Qualität sehr gut reproduzierbar. Die in vitro µCt-Analyse zeigte einen hohen Gehalt an mineralisiertem Gewebe (BV/TV) an Tag 0 und eine deutliche Zunahme des Knochenvolumens (BV/TV) über zwei Monate. Zu Beginn (Tag 0) zeigten 3D-rekonstruierte Bilder eine Mineralisierung, die hauptsächlich am Rand zu finden war und das Gewebe bei der weiteren Kultivierung durchdrang. Diese Ergebnisse werden durch positive von Kossa- und Alizarin Rot-Färbungen unterstützt. Ebenfalls wurde eine deutliche Expression osteoinduktiv-relevanter Gene (SPP1, Dlx5 und VEGF) nachgewiesen. Zusätzlich konnte über Osteopontin- bzw. Osteocalcin-Färbungen die Existenz von Osteoblasten gezeigt werden. Immunhistochemische Färbungen zeigten eine hohe ALP-Aktivität und Col I-Expression, während Col II nicht exprimiert wurde.

Diskussion:

Unsere Studie zur Entwicklung 3D-Knochen-ähnlicher Modelle belegt ein erfolgreiches Herangehen an die Modellierung der endochondralen Ossifikation in vitro durch die nachgewiesene Mineralisierung, die Hochregulation osteogen-relevanter Marker sowie von ALP-Aktivität und Col I-Expression.