Korrektur der Morbus Wilson Punktmutation H1069Q in iPSCs mittels CRISPR/Cas9 Genom-Editierung

Morbus Wilson (MW) ist durch toxische Kupferansammlungen, hauptsächlich in der Leber und im zentalen Nervensystem, gekennzeichnet. Die Punktmutation H1069Q ist die häufigste Mutation des Kupfertransporters ATPase7B in westlichen Populationen. Ein Ziel dieser Studie war es zu prüfen, ob eine CRISPR/Cas9-vermittelte Genkorrektur in MW-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) deren Fähigkeit zur Differenzierung in hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) beeinträchtigen oder hemmen kann. Ein weiteres Ziel bestand darin, das Potenzial der HLCs zur Wiederherstellung der Kupferresistenz zu bewerten, was auf die Funktionalität von ATPase7B hinweist. In dieser Studie wurden Harnepithelzellen von MW-Patienten, die die heterozygote Mutation H1069Q/N1270S tragen, mittels transienter Transfektionsmethoden zu iPSCs umprogrammiert. Zur Einleitung der homologiegerichteten Reparatur wurden iPSCs mit dem Plasmid PX459.H1069Q und einer Reihe einzelsträngiger Oligo-DNA-Nukleotide transfiziert. Einzelne iPSC-Klone wurden mittels Sanger-Sequenzierung analysiert. In 46% aller analysierten iPSC-Klone wurde die H1069Q Mutation erfolgreich korrigiert. Die zweite Mutation N1270S war nicht betroffen. Die korrigierten iPSC-Klone wurden in HLCs differenziert und mittels real-time-RT-PCR auf hepatozytenspezifische Markergene untersucht. Mittels MTT-Tests wurde die Zellvitalität bzw. -proliferationsrate von ATP7B-korrigierten und unkorrigierten HLCs nach Inkubation in toxischen Kupferkonzentrationen bestimmt. Die korrigierten HLCs zeigten eine Hochregulierung hepatozytenspezifischer Markergene (ATP7B, Albumin, AFP, TTR, TF, HNF4α, MDR1, CAR1, APOA1) sowie eine verbesserte Resistenz gegenüber hohen Kupferkonzentrationen. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die CRISPR/Cas9-Technik bei iPSCs hocheffizient ist und ihre Fähigkeit zur Differenzierung in HLCs nicht beeinträchtigt. Diese Technologie verfügt über ein bemerkenswertes therapeutisches Potenzial zur Korrektur des ATP7B-Gens und trägt somit zu neuen Therapieansätzen für MW bei.

Publication History

Article published online:
20 January 2025