Zusammenfassung
Liposome (100-120) von Dipalmitoylphosphatidycholin, hydriertem
Soja-Phosphatidylcholin, Cholesterol und Poly-(Ethylenglykol)
(PEG)-modifiziertem Phosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) bei einem molaren
Verhältnis von (2:1:0,6:0,09) wurden gegen die extrazelluläre
Domäne von HER2/ neu mit FAB-Fragmenten eines humanisierten rekombinanten
monoklonalen Antikörpers konjugiert, um thermosensitive, sterisch
stabilisierte Immunoliposome als Medikamententräger zu schaffen, die auf
überexprimierende HER2-Krebszellen abzielen. Die Konjugation erfolgte
durch eine neue Insertionstechnik, bei der der Antikörper zuerst mit PEG -
DSPE konjugiert wurde und anschließend nach der Bildung zu den sich
ergebenden Liposomen hinzugefügt wurde. Die Konjugation des
Antikörpers mit den Liposomen beeinflusste nicht die
Gesamtgröße der Liposome, wie durch die dynamische
Lichtstreuungstechnik bestimmt wurde. Die Liposome wurden unter Verwendung der
Ammoniumsulfat-Gradientenmethode mit Doxorubicin als antineoplastische Substanz
geladen. Es stellte sich heraus, dass die sich ergebenden
antikörper-konjugierten Vesikel in 50 % des menschlichen Plasmas, in 50 %
des Rattenplasmas und in 10 % des Kalbsfötusserums stabil waren, indem sie
eine minimale Freisetzung des Medikaments bei 37 °C und einem pH-Wert von
7,2 zeigten. Ein Absenken des pH- Wertes auf 5,5 beeinflusste die Freisetzung
des Medikaments von den Liposomen nicht. Durch eine Erhöhung der
Temperatur auf 42 °C wurde jedoch die Freisetzung des Medikaments in den
verschiedenen biologischen Medien verursacht. Eine Änderung der
Bilayer-Zusammensetzung, um nicht thermosensitive, sterisch stabilisierte
Immunoliposome unter Verwendung von hydriertem Sojaphosphatidylcholin,
Cholesterol und Poly- (Ethylenglykol) (PEG)-modifiziertem
Phosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) bei einem molaren Verhältnis von
(1,5:1:0,1) zu bilden und durch Anlagerung des mit Doxorubicin geladenen
Antikörpers (anti-HER2) an die Liposome, verursachte eine minimale
Freisetzung des Medikaments in den verschiedenen biologischen Medien bei 37
°C und 42 °C. Die Aufnahme von Anti-HER2-Immunoliposomen durch
überexprimierende HER2-Zellen (SKBR-3-Zellen) stellte sich als achtfach so
stark heraus wie bei den nicht zielgerichteten Liposomen, und zwar sowohl bei
den thermosensitiven als auch nicht thermosensitiven Liposomen. Die
Antitumor-Aktivität beider Arten von Liposomen wurde durch Messung der
Zell-Zytotoxizität nach der Liposomeninkubation mit Zellen gemessen. Die
Ergebnisse zeigten, dass bei 37 °C (sowohl zielgerichtete oder nicht
zielgerichtete) thermosensitive Liposome beim Abtöten von Zellen
effizienter waren als (sowohl zielgerichtete oder nicht zielgerichtete) nicht
thermosensitive Liposome. Der berechnete IC50 für die
zielgerichteten thermosensitiven Liposome ähnelte stark dem berechneten
IC50 (0,6 µg/ml) für freies Doxorubicin. Außerdem
ähnelte der zytotoxische Effekt von nicht zielgerichteten
thermosensitiven, sterisch stabilsierten Liposomen ziemlich dem von
zielgerichteten, nicht thermosensitiven, sterisch stabilisierten Liposomen
(IC50 für nicht zielgerichtete thermosensitive Liposome = 3
µg/ml, IC50 für zielgerichtete, nicht thermosensitive
Liposome = 2,5 µg/ml). Die Erwärmung der Zellen auf 42 °C
für eine Stunde nach der Liposomeninkubation führte jedoch bei beiden
Arten von Liposomen zu keiner Steigerung des zytotoxischen Effekts. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Liposomenzusammensetzung eine äußerst
wichtige Rolle in der Abgabe von Medikamenten an bestimmte Tumorzellen spielt
und diese Rolle ist möglicherweise genauso wichtig wie die zielgerichtete
Einheit. Außerdem leistet die schnelle Freisetzung des Medikaments durch
einen externen Faktor, wie z.B. die Temperatur, möglicherweise keinen
direkten Beitrag zur Wirksamkeit der Liposome als Trägermedium für
das zielgerichtete Medikament.
Summary
Liposomes (100-120) of Dipalmitoylphosphatidycholine, hydrogenated
soy phosphatidylcholine, cholesterol, and poly-(ethylene glycol) (PEG)-modified
phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) at a molar ratio of (2:1:0.6:0.09) were
conjugated to Fab' fragments of a humanized recombinant monoclonal antibody
against the extracellular domain of HER2/ neu to
create thermosensitive sterically stabilized immunoliposomes as a drug carrier
targeting HER2-overexpressing cancers. Conjugation was performed by a new
insertion technique, in which the antibody was first conjugated to PEG-DSPE
first, then added to the resultant liposomes after being formed. Conjugation of
the antibody to the liposomes did not affect the overall size of the liposomes
as determined by dynamic light scattering technique. The liposomes were loaded
with doxorubicin as an anticancer drug using ammonium sulphate gradient method.
The resultant antibody conjugated vesicles were found to be stable in 50 %
human plasma, 50 % rat plasma and 10 % fetal calf serum by showing a minimal
release of the drug at 37°C and pH = 7.2. Lowering the pH to 5.5 did not
affect the release of the drug from the liposomes. However, raising the
temperature to 42°C caused the release of the drug in the different
biological mediums. Changing the bilayer composition to form a non
thermosensitive sterically stabilized immunoliposomes by using hydrogenated soy
phosphatidylcholine, cholesterol, and poly-(ethylene glycol) (PEG)-modified
phosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) at a molar ratio of (1.5:1:0.1) and
attaching antibody (anti HER2) to the liposomes after loading it with
doxorubicin caused minimal release of the drug in the different biological
mediums at 37°C and 42°C. Uptake of anti-HER2 immunoliposomes by
HER2-overexpressing cells (SKBR-3 cells) were found to be 8 times more than non
targeted liposomes for both thermosensitive and nonthermosensitive. The
antiturnor activity for both kinds of liposomes was evaluated by measuring the
cell cytotoxicity after liposome incubation with cells. The results showed that
thermosensitive liposomes (either targeted or non targeted) were more effective
in terms of cell killing than nonthermosensitive liposomes (either targeted or
non targeted) at 37°C. In fact, the calculated IC50 for targeted
thermosensitive liposomes was quite similar to the calculated IC50
(0.6 µg/ml) for free doxorubicin. Moreover, the cytotoxic effect of
non-targeted thermosensitive sterically stabilized liposomes was quite similar
to targeted non-thermosensitive sterically stabilized liposomes
(IC50 for non-targeted thermosensitive = 3 µg/ml,
IC50 for targeted non-thermosensitive = 2.5 µg/ml). However,
heating the cells to 42°C for one hour after liposome incubation did not
enhance the cytotoxic effect for both kinds of liposomes. These results
indicate that liposome composition plays a very important role in the delivery
of drugs to certain tumor cells, and this role may be as important as the
targeting moiety. Moreover, fast release of the drug by an external factor such
as temperature may not have a direct contribution on the efficiency of the
liposomes as a targeting drug delivery vehicle.
Schlüsselwörter
Liposome - Doxorubicin - Anti-HER2 - Brustkrebs - Temperatur - Zytotoxizität - Zellaufnahme - Fluoreszenz
Keywords
Liposomes - Doxorubicin - Anti-HER2 - coping - Breast Cancer - Temperature - Cytotoxicity - Cellular Uptake - fluorescence
