Hydrophobe Gallensalze aktivieren die NADPH-Oxidase und die CD95-vermittelte hepatozelluläre Apoptose über eine endosomale Azidifizierung

Einleitung: Hydrophobe Gallensalze aktivieren die NADPH-Oxidase (Nox)-abhängige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) über einen Ceramid- und PKCζ-abhängigen Signalweg als ein frühes Element der Gallensalz-induzierten hepatozellulären Apoptose.

Methoden: In Rattenhepatozyten und Hepatozyten von p47^phox k.o. Mäusen wurde die Expression der Nox mittels PCR, W.blot und Immunzytochemie nachgewiesen, intrazell. Ceramidspiegel mittels HPTLC und ROS-Bildung mittels DCFDA-Fluoreszenz gemessen, der vesikuläre pH-Wert mittels endozytiertem FITC-Dextran und die zytosol. [Cl^-] mittels MQAE-Fluoreszenz in Einzelzellen bestimmt. Ein knockdown der sauren Sphingomyelinase (ASM) wurde durch Antisense-Oligonukleotide induziert und die CD95/EGFR-Assoziation und Membrantranslokation mit Hilfe der FRET-Mikroskopie in EGFR-CFP /CD95-YFP kotransfizierten Huh7 visualisiert. Zellschrumpfung der Hepatozyten wurde in der perfundierten Leber von Ratten und Wildtyp-/p47^phox k.o. Mäusen mit Hilfe der Auswaschprofile von [¹⁴C]Harnstoff und [³H]Inulin berechnet.

Ergebnisse: Proapoptotische Gallensalze wie TLCS, aber nicht „neutrale“ wie TC, senkten den pH-Wert eines endosomalen Kompartimentes, in dem auch die Expression der ASM nachgewiesen werden konnte, binnen Sek. von 6.0 auf 5.6. Gleichzeitig konnte ein schneller Anstiegs der zytosolischen [Cl^-] gezeigt werden, der die vakuoläre H⁺-ATPase zu aktivieren vermag. Hemmung der TLCS-induzierten endosomalen Azidifizierung mittels Bafilomycin oder DIDS hemmte die TLCS-induzierte Ceramid-Bildung, p47^phox-Serinphosphorylierung, ROS-Bildung, CD95-Aktivierung und Apoptose. Das gleiche Bild zeigt sich auch nach ASM-knockdown in Rattenhepatozyten und in Hepatozyten aus der p47^phox k.o. Maus. Desweiteren zeigte sich eine durch die TLCS-induzierte ROS-Bildung vermittelte Zellschrumpfung der Hepatozyten, die durch Desipramin, Apocynin, Bafilomycin und DIDS hemmbar und in der p47^phox k.o. Maus stark vermindert war.

Diskussion: Hydrophobe, proapoptotische Gallensäuren aktivieren Nox-Isoformen über eine Chlorid-abhängige Azidifizierung von Endosomen, welches die ASM-abhängie Ceramid-Bildung auslöst und zur PKCζ-vermittelten Serinphosphorylierung der p47^phox führt. Der hieraus resultierende ROS triggert nicht nur die CD95-Aktivierung, sondern führt auch zu einer hepatozellulären Zellschrumpfung. Da Zellschrumpfung für sich genommen selbst eine ROS-Bildung induziert, wird ein Teufelskreis initiiert, der in der hepatozellulären Apoptose mündet.