Induktion basaler Signaltransduktionswege in primären Maus-Hepatozyten durch Medienwechsel

Einleitung: Maushepatozyten werden oft in vitro eingesetzt, um die Toxizität von Wirkstoffen zu bestimmen oder Signalkaskaden der Leber zu untersuchen. Diese Untersuchungen finden meistens im batch-Verfahren statt, bei dem das Kulturmedium alle 24h erneuert wird. Dabei wird oft nicht berücksichtigt, dass die Hepatozyten die Komponenten des Kulturmediums selektiv verstoffwechseln und es innerhalb kürzester Zeit auch in nicht-stimulierten Hepatozyten zu Veränderungen der Zusammensetzung des Kulturmediums kommt. Ziel dieser Arbeit ist es, diese Veränderungen und deren Folgen auf der Ebene der Signalkaskaden zu untersuchen.

Methoden: Hepatozyten wurden aus C57BL/6 Mäusen isoliert, 24h in Williams E Medium mit 5 mM Glutamin, 100 nm Dexamethason und Pen./Strep. kultiviert. Während der ersten 4h wurde das Medium zusätzlich mit 10% FCS supplementiert. Anschließend fand ein Medienwechsel statt. Die Zusammensetzung des Kulturüberstandes wurde alle 2 Stunden analysiert, die spezifische Aktivität der Pyruvatkinase verfolgt und die Genexpression der Zellen zu den unterschiedlichen Zeitpunkten mit Affymetrix Gene-Arrays charakterisiert.

Ergebnisse: Als Folge des Mediumwechsels nehmen die Konzentrationen der Aminosäuren Alanin und Glycin kontinuierlich ab. Arginin nimmt, bedingt durch die Arginase der Hepatozyten innerhalb der ersten 2h ab. Die Harnstoff-Konzentration steigt kontinuierlich über die Versuchsdauer an, was darauf hindeutet, dass die Aminosäuren für den Energiestoffwechsel verwendet werden, insbesondere, da die Glukosekonzentration über 24h fast unverändert bleibt. Es kommt zu einem Anstieg der Pyruvat-Kinase mRNA, gefolgt von einem Anstieg in der spezifischen Enzymaktivität nach 6–8h. Die Veränderungen in der Genexpression von 8 zentralen Stoffwechselwegen lässt sich in 5 Clustern mit ähnlichem Verlauf zusammenfassen. Das deutet darauf hin, dass übergeordnete Regelmechanismen vorhanden sind, die auf den Medienwechsel reagieren. Überraschenderweise werden Gene des TGFβ-, des Wnt/β-Catenin und der Jak/Stat Signalkaskade aktiviert. Dies zeigt, dass bereits Änderungen von Metaboliten im Kulturmedium zu Änderungen der Transkriptionsaktivität führen.

Aminosäuren - Gen-Array - Glukose - Modellierung - Systembiologie