Mutationsanalyse der Tumorsuppressorgene p16^INK4 und Mxi-1 beim lokalisierten Prostatakarzinom

Zusammenfassung:

Die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSC) bzw. die unphysiologische Aktivierung von Onkogenen stellt ein molekularbiologisches Schlüsselereignis in der Entwicklung humaner Malignome dar. Für das Prostatakarzinom (Pca) wurde noch kein spezifisches Gen identifiziert, die chomosomalen Loci 9 p21 und 10q24 - 25 zeigen jedoch einen LOH in 72% bzw. 56% der Pca und lassen vermuten, daß die beiden TSC p16 (9p21) und Mxi-1 (10q24) in die molekulargenetische Pathogenese des Pca involviert sein könnten. Wir führten eine Mutationsanalyse beider TSG beim lokalisierten Pca durch, um diese Hypothese zu überprüfen. 38 Tumor-/Normal-DNApaare sowie die Pca-Zellinien LNCaP, DU 145, PC 3, DuPro und 1 LN wurden mittels Blot-Analyse zum Nachweis von homozygoten Deletionen, mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR), Single Strand Conformation Polymorphism-Analyse (SSCP) und direkter DNA-Sequenzierung auf das Vorliegen von Mutationen analysiert. Für p16 wurden 5 spezifische Primerpaare zur Amplifikation der Exons 1 - 3 eingesetzt, für Mxi-12-Primerpaare für die HLH- sowie die ZIP-kodierende Region. Sowohl für p16 als auch für Mxi-1 wurden keine homozygoten Deletionen in den primären Tumorproben und bei den Zellinien beobachtet. Die PCR-basierte Mutationsanalyse zeigte für p16 eine Missense-Mutation (Codon 84: GAC zu TAC, asp zu tyr) sowie eine stille Mutation der DU145 Zellinie; für die primären Pca wurde in einem Fall eine stille Mutation beobachtet. Für das Mxi-1-Gen wies keine der Zellinien einen Bandenshift bei SSCP-Analyse oder eine Mutation auf. Für die primären Pcas konnte ein Mobilitätsshift im Rahmen der SSCP in 5/32 Tumoren (15.6%), aber nicht in den Normalproben nachgewiesen werden. Die direkte DNA-Sequenzierung konnte in allen Fällen eine Missensmutation in der HLH-kodierenden Domäne bzw. in der ZIP-kodierenden Domäne nachweisen. Der fehlende Nachweis signifikanter Mutationen für das p16 TSC und die geringe Mutationsfrequenz für das Mxi-1-Gen lassen vermuten, daß beide TSG keine entscheidende Rolle in der Pathogenese des lokaliserten Pcas spielen. Die hohe LOH-Frequenz für 9p21 und 10q24-25 läßt vermuten, daß zumindest ein weiteres noch nicht identifiziertes TSG von den chromosomalen Loci kodiert wird.

Abstract

The p16 gene product is a negative cell cycle regulator and has been shown to be inactivated in a number of primary tumors and cell lines. Overex-pression of the myc-family genes has been shown to promote cellular transformation. Myc gene transcriptional activity is regulated by the stimulating and suppressive effects of the Max and Mxi-1 proteins, respectively. Since the role of both tumor suppressor genes in prostate cancer still has not yet been defined, prostate cancer tissue and cell lines were evaluated for genetic alterations. Five metastatic prostate cancer cell lines and 38 microdissected primary tumor specimens and adjacent normal tissue were analyzed for p16 and Mxi-1 gene structure by Southern Blot analysis, polymerase chain reaction (PCR) followed by single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) and direct DNA sequencing of samples with aberrant mobility shifts. The prostate cancer cell line Du 145 revealed the previously described missense mutation (codon 84, GAC to TAC); while 3 primary prostate cancer samples demonstrated the same p16 polymorphism, but no significant missense mutations or deletions. With regard to the Mxi-1 gene none of the cell lines, but 5/32 (15.6%) primary tumors revealed an aberrant band shift PCR-SSCP. Direct DNA sequencing demonstrated a C to T base substitution for the HLH-region. Based on the low frequency of genetic alterations, inactivation of the tumor suppressor genes p16 and Mxi-1 by deletions or mutations in the protein coding region does not seem to play a major role in the tumor genesis of localized prostate cancer.

Key words:

Prostate cancer - p16 - Mxil - Tumor suppressor genes