Biomarker bei infektiösen und nicht infektiösen Lungenerkrankungen außer Malignome

Einleitung

Es gibt keine einheitliche Biomarker-Definition. Je nach Fachgebiet wird der Begriff Biomarker z. T. in sehr unterschiedlicher Weise angewendet. In der Medizin können Biomarker als messbare Produkte, die als Indikatoren z. B. für Umweltbelastungen oder Krankheiten herangezogen werden können, definiert werden. Man kann zwischen integralen und spezifischen Biomarkern unterscheiden, wobei integrale Biomarker eine Menge von möglichen Abweichungen anzeigen, während spezifische Biomarker einzelne Indikatoren für eine konkrete Situation, z. B. einen Stoffwechselschritt, beschreiben. Bezogen auf die Medizin sind Biomarker somit Faktoren, die sich aus Körperflüssigkeiten oder Zellen isolieren und meist auch quantifizieren lassen und einen (medizinischen) Zustand anzeigen. Sie haben somit im Idealfall eine diagnostische Aussagekraft, eignen sich zur Prognoseabschätzung, zu Therapieentscheid und -steuerung sowie zur Einschätzung der Schwere der zugrunde liegenden Erkrankung. Sie können z. B. auf das Fortschreiten einer Erkrankung hinweisen oder den Behandlungserfolg oder -misserfolg definieren. Entscheidend ist für den praktischen Einsatz in der Medizin, ob ein oder mehrere Biomarker für die erwartete Zielaussage eine hohe Spezifität und Sensitivität besitzen, die diagnostische mit anderen Methoden erzielbare Aussage erhärten oder bestätigen können. Ist das nicht der Fall oder wird der/die Biomarker von Störfaktoren beeinflusst, ist die Bestimmung des/der Biomarker nur bedingt verwertbar oder sinnlos.

Es gibt im pneumologischen Fachgebiet keine Erkrankung, zu der nicht irgendein Biomarker evaluiert wurde. Ziel dieser Übersicht ist es, an pneumologisch wichtigen Erkrankungen die Wertigkeit neuerer Biomarker oder älterer Biomarker, zu denen es neuere, für die praktische Anwendung wichtige Studienergebnisse gibt, exemplarisch vorzustellen.

Die Fülle der möglichen Biomarker ist unübersehbar und variiert ständig, weil täglich neue hinzukommen oder alte verworfen werden. Ungeachtet dessen haben sich viele Biomarker in der pneumologischen Diagnostik durchgesetzt und besitzen eine überaus wichtige Aussagekraft mit entsprechender Konsequenz für die Therapiesteuerung, wie z. B. aus dem Blut bestimmte Laborwerte. Wegen dieser Informationsfülle und aus Gründen der besseren Übersicht konnten in dieser Übersicht nur Teilaspekte dieses Themas beleuchtet werden. Der Fokus liegt auf Biomarkern nicht maligner Erkrankungen. Zudem wurden Aspekte zur Genetik und die broncho-alveoläre Lavage (BAL) ausgeklammert. Wo eine Abschätzung der Wertigkeit bestimmter Biomarker möglich und eine solche anerkannt ist, wurde diese vorgenommen.

COPD

Ziel der ECLIPSE-(Evaluation of COPD Longitudinally to identify Predictive surrogate End-points)-Studie ist es unter anderem, mit Hilfe von aus dem Blut, Urin, Sputum und Atemkondensat zu bestimmenden Biomarkern COPD-Subgruppen zu identifizieren [1]. Alleine die Durchführung eines solchen Studienansatzes weist darauf hin, dass es keine Biomarker gibt, mit denen sicher z. B. zwischen einem Asthma und einer COPD oder zwischen Therapie-Responder oder -non-Responder unterschieden werden kann oder die eine für den praktischen Patientenumgang bedeutungsvolle prognostische Aussage erlauben würden.

Sputum

Der in den Atemwegen der COPD und damit auch im Sputum dominierende Zelltyp sind die neutrophilen Granulozyten [2]. Der steigende Anteil von Sputumneutrophilen ist mit steigenden Sputumkonzentrationen von IL- (Interleukin) 8 und MPO (Myeloperoxidase) und mit einem schnelleren FEV₁-Abfall pro Jahr assoziiert [3]. Eine erhöhte Sputum-Eosinophilenanzahl (≥ 1,3 %) ist dagegen mit einem besseren Therapieansprechen (FEV1, Dyspnoesymptomatik, Gehstrecke) auf Kortikosteroide assoziiert, als bei Patienten, bei denen im Sputum eine neutrophile Entzündung dominierte [4] [5]. Im Sputum sind in der Vergangenheit darüber hinaus eine Fülle von Entzündungsmediatoren quantifiziert worden, die mit der COPD und der Lungenfunktionseinschränkung korrelieren sollen, z. B. IL-8, LTC-4, MCP-1, Lipocalin, Metallo- und andere -Proteasen, diverse Leukotriene und Proteasen [6] [7] [8].

Während einer Exazerbation steigen die im Sputum gemessenen Entzündungsmediatoren und der Anteil an neutrophilen Granulozyten an. Das Vorhandensein einer bakteriellen bronchialen Infektion korreliert mit dem Anteil neutrophiler Granulozyten im Sputum. Eine gelbliche oder gelb-grünliche Verfärbung des Sputums weist ebenfalls auf einen bakteriellen Infekt hin und gilt als Marker zur Indikation einer Antibiotikatherapie [9]. Darüber hinaus erwies sie sich als positiver prognostischer Marker eines Antibiotikatherapieerfolgs [9]. Obwohl der Eosinophilenanteil im Sputum eher ein Charakteristikum des Asthmas ist, wurde auch bei der COPD ein solcher Anstieg sowohl in der stabilen Erkrankungsphase als auch während der Exazerbation mit erhöhten ECP-(eosinophiles cationisches Protein)-Werten beobachtet. Darüber hinaus wurden bei der Exazerbation sowohl in der Bronchialschleimhautbiopsie als auch im Sputum erhöhte CD-8-positive T-Lymphozyten und reduzierte CD-4-positive T-Zellen nachgewiesen [10] [11] [12].

Das Sputum eignet sich bei ordnungsgemäßer Abnahme zur bakteriologischen Diagnostik einschließlich Keimisolation, Bestimmung der Keimzahl und Durchführung eines Antibiogramms [13] [14]. Zusammenfassend hat nur die Beurteilung der Sputumfarbe und die aus dem Sputum durchführbare bakteriologische Diagnostik Eingang in die tägliche Routine gefunden, nicht jedoch die Fülle aller anderen Sputum-Biomarker [15] [16] [17].

Bronchialschleimhautbiopsie

In der Bronchialschleimhautbiopsie ([Abb. 1] u. [2]) wurden bei einer Exazerbation mehr eosinophile Granulozyten, Lymphozyten, Eotaxien, CCR-3 nachgewiesen [11] [18] [19].

Abb. 1 Lungenbiopsie bei einem COPD-Patienten mit einem ausgeprägten Lungenemphysem und Mischstaubsilikose; v. Gieson Färbung, × 5. A: Emphysemblasen, B: Staubeinlagerungen.

Abb. 2 Lungenbiopsie bei einem COPD-Patienten mit einem Lungenemphysem. Deutlich sind die Ansammlungen von mononukleären und granulozytären Zellen (Pfeile) erkennbar; v. Gieson, × 20. A: Emphysemblasen, B: Pulmonalarteriole.

Zudem steigt auch der Anteil von Neutrophilen und deren Stoffwechselprodukte während einer Exazerbation an, ohne dass sich die chemotaktischen Eigenschaften vom Sputum erhöhen [20]. Schleimhautbiopsien der Atemwege haben für die COPD-Diagnostik- und Therapiesteuerung keine Wertigkeit in der täglichen Praxis sind aber evtl. für klinische Medikamentenprüfungen zur Evaluation etwaiger Medikamentenwirkungen auf zellulärer Ebene bzw. pathophysiologischer Zusammenhänge aus wissenschaftlicher Sicht interessant.

Atemkondensat

Im Atemkondensat wurden bei COPD-Patienten u. a. pH, H2O2, Zytokine, Leukotriene, Isoprostane, Nitrit/Nitrat und für den oxidativen Stoffwechsel bedeutsame Entzündungsmarker quantifiziert [21]. Viele dieser Marker korrelierten mit klinischen Parametern. So wurden z. B. H2O2, Interleukine, Leukotriene, Prostaglandin E2 (PGE2) und 8-Isoprostane bei der Exazerbation erhöht gemessen oder sie sinken bei einer erfolgreichen Therapie im weiteren Verlauf nach Exazerbation. Eine gute Lungenfunktion (FEV1) prädisponiert dagegen für niedrige Entzündungsmarker im Atemkondensat und umgekehrt [22] [23] [24]. Die Daten sind aber nicht einheitlich, was vor allem an dem methodischen Problem der im Atemkondensat niedrigen, meist knapp über der unteren Nachweisgrenze gemessenen Substanzkonzentrationen liegt [21]. Zudem ist die Reproduzierbarkeit von der Sammel- und Analysetechnik der Exhalatflüssigkeit abhängig, und die Methode ist bis heute nicht verlässlich validierbar, was eine Vergleichbarkeit zwischen den publizierten Studien erschwert [25] [26] [27].

Exhaliertes Stickstoffmonoxid (FeNO)

Die Höhe des exhalierten Stickstoffmonoxids (FeNO) korreliert mit dem Anteil eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen, weswegen sie sich in der Asthmadiagnostik (s. u.) eignet [28] [29] [30] [31]. Da in den Atemwegen von COPD-Patienten typischerweise ein erhöhter Neutrophilenanteil dominiert und zudem Zigarettenrauchen FeNO senkt, besitzen FeNO-Messungen bei der stabilen COPD keinerlei zusätzlichen Aussagewert [29] [31].

Labordiagnostik aus dem Blut

Wie auch schon im Sputum und in der BAL sind bei COPD-Patienten im Vergleich zu den gesunden Kontrollen die Neutrophilenzahlen im peripheren Blut zusammen mit dem zellulären Aktivitätsstatus dieser Zellen erhöht. Auch der Anteil an zirkulierenden CD-8-positiven T-Lymphozyten ist höher als bei den nicht rauchenden Kontrollen [32]. Pulmonale Kachexie und Muskelatrophie korrelieren mit einem Anstieg der systemischen Inflammation, gemessen an erhöhten TNFα, IL-6 und Interferon-Gamma-Spiegeln [33] [34]. Im Vergleich zu gesunden Kontrollen waren des Weiteren folgende Mediatoren im Blut von COPD-Patienten erhöht gemessen worden: IL-8, MMP-9, MCP-1, VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor), ECP, MPO, ICAM, CD40L und Endothilin-1 [35]. Zusätzlich steigen während der Exazerbation die Plasmaspiegel für Fibrinogen (Fbg) und IL-6 und einige andere an, einschließlich ECP, löslicher IL-5-Rezeptor alpha, Interferon-induziertes Protein C oder Plasmaamyloid A [36].

Das C-reaktive Protein (CRP) wurde bei COPD-Patienten im Blut erhöht gemessen und als mortalitätshinweisender und damit prognostisch bedeutsamer Faktor diskutiert [7]. Insgesamt zeigen die CRP-Studien allerdings ein uneinheitliches Ergebnis, da nicht alle Patienten mit einer Exazerbation auch erhöhte CRP-Spiegel aufwiesen. Zudem sind erhöhte CRP-Konzentrationen unspezifisch und lassen weder eine verlässlich Aussage über die zugrunde liegende Infektion (Bakterien oder Viren) noch eine prognostische Aussage über den weiteren Erkrankungsverlauf in Bezug auf COPD-Exazerbationsrate, die Lungenfunktion oder die Hospitalisierungsrate zu [37].

Im Gegensatz zur ambulant erworbenen Pneumonie wird die Bedeutung einer Procalcitonin-basierten Therapiesteuerung bei der COPD-Exazerbation bzgl. der Überlegenheit gegenüber dem bisher praktizierten Standardverfahren kontrovers diskutiert [7] [38] [39]. Eine Erniedrigung des im Blut gemessenen Fbg-/CRP-Quotienten korrelierte allerdings mit dem Anstieg der Mortalität (all-cause Mortalität [40]). Gleiches wurde auch bei einem erniedrigten Hb-Wert (< 13 g/dl) beobachtet [41].

BNP (B-type natriuretic peptide) ist ein 32-Aminosäuren umfassendes Peptid, das vor allem in beiden Herzkammern freigesetzt wird. Die inaktive Form (Nt-proBNP = N-terminales Frament) wird für die Diagnostik verwendet und verbessert zusammen mit den schon bekannten kardialen Risikofaktoren die Prognoseabschätzung bei einer Herzinsuffizienz und die der Risikostatifikation nach einem akuten Koronarsyndrom [42] [43] [44] [45] [46]. BNP hat eine Fülle von physiologischen Aufgaben, so u. a. den Natriumhaushalt, die Diurese und es wirkt vasodilatatorisch. Unter anderem wirkt die myokardiale Dehnung als Stimulus zur BNP-Freisetzung, weswegen erhöhte BNP-Plasmaspiegel bei der Herzinsuffizienz, aber auch bei einer Erhöhung des rechtsventrikulären Drucks gemessen werden [46] [47] [48]. Bei der COPD-Exazerbation lagen die BNP-Spiegel im Mittel um ca. ⅓ höher als in der anschließenden Erholungsphase (65 pg/ml vs. 45 pg/ml, p < 0,001). Intensivpflichtige Patienten wiesen sogar noch höhere BNP-Werte auf (105 pg/ml) und besaßen damit einen schwach positiven prädiktiven Wert für die Intensivpflichtigkeit (HR 1,13; 95 %-Konfidenzintervall 1,03 – 1,24, ab BNP 100 pg/ml, p = 0,008), nicht aber für ein erhöhtes Mortalitätsrisiko [39]. Pathophysiologisch wird als Ursache für die BNP-Erhöhung eine hypoxiebedingte Kontraktion der Pulmonalarterien mit konsekutiver Steigerung des rechtsventrikulären Drucks angenommen [39], obwohl bei der Exazerbation auch eine begleitende linksventrikuläre diastolische Funktionsstörung mit valvulärer Dysfunktion und in der Folge eine Rechtsherzbelastung in Frage kommen könnten [49] [50]. Der BNP-Wert erlaubt eine Differenzierung, ob bei einer geklagten Dyspnoe primär eine dekompensierte Herzinsuffizienz oder eine pulmonale Ursache zugrunde liegt, da eine Herzerkrankung mit sehr hohen Werten (im Mittel 731 pg/ml) einhergeht. Sie erlauben aber keine Unterscheidung, ob sie durch eine primär kardiale Erkrankung oder bei pulmonalen Erkrankungen mit sekundärer Herzbelastung erhöht gemessen wurden. Die hohe Streubreite dieser Werte weist darauf hin, dass auch der BNP-Wert die Standarddiagnostik nur unterstützt [46] [51]. [Abb. 3] gibt eine konkrete diagnostische Abschätzung der Werte in der Herzinsuffizienzdiagnostik.

Abb. 3 a Je höher die BNP-Serumspiegel sind, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer Herzinsuffizienz. b Bei Patienten mit einer chronischen Herzinsuffizienz sind die BNP-Basiswerte erhöht, was den Aussagewert der BNP-Bestimmung einschränkt. Zudem besteht eine Altersabhängigkeit. Der Graubereich liegt zwischen 100 und 400 pg/ml. Die angegebenen Werte haben eine sehr hohe Herzinsuffizienzwahrscheinlichkeit [46]. BNP = B-type natriuretic peptide

Zusammenfassend ist es auch mit Plasma-Biomarkern bei der COPD nicht möglich, den Erkrankungszustand (Schwere) auf verlässliche Art und Weise näher zu charakterisieren. Sie erlauben für den individuellen Patienten keine verlässliche prognostische Aussage über die weitere Erkrankungsentwicklung bzw. die Notwendigkeit der Einleitung oder des Absetzens bestimmter Therapien, auch wenn einzelne Studien auf eine solche Möglichkeit hindeuten [52]. Erhöhte BNP-Serumwerte weisen lediglich auf eine gleichzeitige Herzbelastung hin.

Alpha-1-Antitrypsin-Mangel

Im Gegensatz zur COPD wird der autosomal dominant vererbte Alpha-1-Antitrypsin-Mangel mittels aus dem Blut bestimmbarer Parameter gesichert, auf denen die Indikation zur Substitutionstherapie basiert [53] [54]. Bei symptomatischen Patienten im Alter von unter 45 Jahren mit einem Lungenemphysem (FEV1 < 65 % des Sollwertes, FEV1-Abfall/Jahr > 120 ml bei FEV1 > 65 % vom Sollwert) oder bei Neugeborenen, Kindern und älteren Erwachsenen mit Lebererkrankungen unklarer Genese oder einer Alpha-1-Antitrypsin-Mangelkrankheit in der Familie sollten die folgenden Tests durchgeführt werden [53] [55] [56] [57]:

• Plasma-Protein-Elektrophorese: Bei einem Alpha-1-Antitrypsinmangel ist die alpha1-Globulinfraktion erniedrigt. Im positiven Fall

• Quantifizierung des Alpha-1-Antitrypsin-Serumspiegels, der im positiven Fall < 40 % des Sollwertes (radiale Immundiffusion < 80 mg/dl, Nephelometrie 50 mg/dl; 11 µM) betragen würde. Im positiven Fall ist eine

• Phänotypisierung mittels isoelektrischer Fokussierung aus dem Serum empfohlen, der im positiven Fall einen Phänotyp PiZ oder PiSZ zeigt.

• Die Genotypisierung ist nur bei speziellen Fragestellungen notwendig.

Ferner müssen bei diesen Patienten ein IgA-Mangel, ein fortgesetzter Nikotinabusus (Nachweis mittels HbCO, Urin-Cotinin), ein dekompensiertes Cor pulmonale und eine Unverträglichkeit gegenüber Blutprodukten ausgeschlossen werden, da dies Ausschlusskriterien für eine Alpha-1-Antitrypsin-Substitutionstherapie sind.

Asthma bronchiale

Sputum

Die eosinophilen Granulozyten und das ECP sind in 80 % aller steroidnaiven Asthmatiker im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöht. Die Sputum-Eosinophilenzahl korreliert mit der Asthmaschwere, der bronchialen Hyperreagibilität, der Peakflow-Variabilität und der Schwere der Asthma-Symptomen-Scores [58]. Bei Asthmapatienten mit einer Allergie führt die Inhalation eines Allergens zu einem Anstieg der Sputum-Eosinophilenzahl, die sich therapeutisch durch eine inhalative Kortikosteroidtherapie senken lässt. Ein Absetzen einer Kortikosteroidbehandlung führt wieder zu einem Anstieg der Sputum-Eosinophilenmenge. Parallel zu den Eosinophilenzahlen steigen die Sputumkonzentrationen von IL-5 (für Eosinophile ein chemotaktisch wirksames Interleukin), MPO, TNF-α, ECP und andere an [59] [60].

Hohe Eosinophilenzahlen im Sputum sind prädiktiv für eine Zunahme von Asthmasymptomen und gehäuften Exazerbationen nach Reduktion oder Absetzen inhalativer Kortikosteroide. Umgekehrt zeigen absinkende Eosinophilenzahlen den Therapieerfolg einer inhalativen Kortikosteroidtherapie mit Reduktion der Exazerbationsrate und asthmabedingter Krankenhausaufnahmen an [61]. Die Diskriminierung zwischen COPD und Asthma ist anhand der Eosinophilenzahlen im Regelfall möglich, wird allerdings in seiner Aussagekraft dadurch eingeschränkt, dass auch COPD-Patienten eine erhöhte Eosinophilenanzahl im Sputum und in der BAL aufweisen können. Eosinophile im Sputum und in der BAL sind bei der COPD mit einem guten Therapieansprechen im Sinne einer höheren Verbesserung der FEV1 unter inhalativen Kortikosteroiden assoziiert als bei Patienten, bei denen im Sputum ein hoher Neutrophilenanteil dominiert [62] [63] [64] [65] [66] [67].

Bronchialschleimhautbiopsie

Biopsien der Bronchialschleimhaut imponieren bei steroidnaiven Patienten durch vermehrte eosinophile Granulozyten, Lymphozyten und Mastzellen im subepithelialen Gewebe sowie der Verbreiterung der Basalmembran und der inflammatorischen Schädigung der Bronchialepithelschicht, die Abschilferung. Umgekehrt konnte bei einem solchen Befund der restitutive Effekt einer inhalativen Kortikosteroidtherapie in eine post-therapeutische Folgebiopsie eindrucksvoll belegt werden [68]. Bioptischen Verfahren beim Asthma kommen in praxi weder eine diagnostische noch prognostische Bedeutung zu, auch wenn in Medikamentenstudien der Therapieerfolg eines Medikaments mittels Bronchialschleimhautbiopsie als Surrogatparameter eindrucksvoll belegt wurde [69].

Zusammenfassend haben in der Routinediagnostik des Asthmas weder die Sputumuntersuchungen noch auf bronchoskopischen Verfahren basierenden Untersuchungen einen Stellenwert, auch wenn in Studien der Therapieerfolg von z. B. einer inhalativen Kortikosteroidtherapie mittels Reduktion von Entzündungszellen und/oder Entzündungsmediatoren in der Bronchialschleimhautbiopsie, in der BAL oder im Sputum nachgewiesen wurde. Die gute mittels klinischer Evaluation und Lungenfunktion mögliche Therapiesteuerung rechtfertigt die genannten methodisch aufwendigen Verfahren allenfalls für wissenschaftliche Fragestellungen.

FeNO

In unbehandelten Asthmapatienten ist das ausgeatmete Stickstoffmonoxid (FeNO) erhöht und korreliert mit der Eosinophileninflammation der Atemwege atopischer (Asthma-) Patienten. FeNO-Konzentrationen korrelieren ferner mit dem Ausmaß der bronchialen Hyperreagibilität, der Reversibilität auf einen Bronchodilatator, der Positivität eines Allergen-Haut-Pricktests, Serum-IgE-Spiegel und Bluteosinophilenmenge. Nicht allergische Asthmapatienten weisen gegenüber Gesunden allerdings einen nur marginal erhöhten FeNO-Wert auf. Die Allergie ist somit die FeNO beeinflussende Erkrankung und weniger das Asthma [70] [71] [72].

Sinkende FeNO-Werte zeigen die Effektivität einer antiinflammatorischen Medikation an, da eine erfolgreiche inhalative Kortikosteroidtherapie mit Reduktion der bronchialen Entzündung auch die FeNO-Werte reduziert. Allerdings zeigen Studien, in denen die Effektivität der Therapiekontrolle zwischen FeNO und der Lungenfunktion/klinische Untersuchung miteinander verglichen wurde, dass die mittels FeNO geführten Patienten statistisch gegenüber den mittels Lungenfunktion geführten Patienten therapeutisch nicht überlegen sind [73] [74]. Ganz im Gegenteil erhöhte sich sogar der inhalative Kortikosteroidverbrauch, ohne dass sich die Lungenfunktion zusätzlich verbesserte, weswegen die FeNO-gesteuerte Therapie wahrscheinlich sogar eine Übertherapie bewirkt [74] [75]. Damit eignet sich FeNO allenfalls nur bedingt zur Therapiesteuerung, obwohl erhöhte Werte mit einem erhöhten Asthmaexazerbationsrisiko assoziiert wurden [75].

Wegen der zahlreichen Einflussfaktoren und der intraindividuellen Schwankungsbreiten gibt es derzeit keine allgemein anerkannten Referenzwerte, obwohl verschiedene Versuche unternommen wurden, solche zu erstellen. Wesentliche Einflussfaktoren sind: Art der Erkrankung, Atemtechnik (Ausatemfluss), Patientenalter, Körpergröße, Geschlecht, Atopiestatus und Raucherstatus [27] [29] [30] [75] [76] [77] [78]. Das Ausmaß dieser Einflussfaktoren auf die FeNO-Messwerte wurde aber in Studien unterschiedlich bewertet. Olin et al. erstellten an 1131 gesunden Nichtrauchern Normwerte für FeNO ([Tab. 1]), die auf den empfohlenen Ausatemfluss von 50 ml/Sekunde [28] normiert wurden [79].

Tab. 1 Obere FeNO-Grenzwerte (ppb), die an 1803 gesunden Nichtrauchern erhoben wurden [79].

Körpergröße	Alter
	25 – 34 Jahre	35 – 44 Jahre	45 – 54 Jahre	55 – 64 Jahre	65 – 75 Jahre
< 160 cm	24,0	24,5	28,8	31,5	34,1
160 – 169 cm	27,4	29,7	32,8	35,9	38,9
170 – 179 cm	31,2	34,1	37,3	40,9	44,3
180 – 189 cm	35,5	38,9	42,5	46,5	50,4
> 190 cm	40,4	44,3	48,4	53,0	57,4

Basierend auf diesem nicht allergischen Normalkollektiv ergibt sich folgende FeNO-Normalwerteformel:

FeNO = – 0,0026 + 0,013 × Körpergröße (cm) + 0,01 × Patientenalter (Jahre)

Biomarker im Blut

Wie auch im Sputum, in der BAL und in den Bronchialschleimhautbiopsien so findet sich auch im Blut von Asthmapatienten eine erhöhte Eosinophilenzahl. Die Behandlung mit Kortikosteroiden führt zu einer Reduktion der Eosinophilenzahl, des ECP und des EPO [80]. Bei Asthmatikern wurden im Blut zudem erhöht gefunden: Eotaxin, IL-4, IL-5, CCR-4, Ligand, TARC und MCP-4 [81] [82] [83]. Bei Allergikern ist zudem der Serum-IgE-Spiegel erhöht, der bei Asthmapatienten des Schwergrades IV für die Indikation einer Omalizumab-Behandlung mit entscheidend ist. Hohe Serum-IgE-Spiegel und eine erhöhte Eosinophilenzahl im Blut sind typisch für das allergische Asthma, welches somit gut von einer COPD unterschieden werden kann [84].

Pneumonie

Bakterielle Infektionen und Sepsis sind die häufigsten Ursachen von Morbidität und Mortalität bei intensivpflichtigen internistischen Krankheitsbildern, wobei die ambulant erworbene Pneumonie (CAP = community aquired pneumonia) altersabhängig mit einer Inzidenz von 1,6 – 10,6 / 1000 Erwachsenen die am häufigsten zum Tode führende Infektionskrankheit darstellt. Eine schnelle und richtige Diagnosestellung sowie eine leitliniengerechte Therapie und Therapiesteuerung verbessert die Prognose dieser Patienten [15] [85] [86] [87] [88]. Ein Therapieversagen stellt bei diesen Patienten einen unabhängigen Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität dar, wie die CAPNETZ-Studie (German competence network for community-acquired pneumonia) zeigte [89]. Daher sind gerade bei diesen Patienten die individuelle Risikoabschätzung und die zeitnahe Therapieüberprüfung auch mit Hilfe von Biomarkern wichtig. Die wichtigsten klinischen Indizes sind vor allem die im CRB-65 Index subsumierten Parameter (confusion, respiratory rate [≥ 30 Atemzüge/Minute], low blood pressure [systolisch < 90, diastolisch ≤ 60 mm Hg], age [≥ 65 Jahre]). Dem gegenüber stehen eine Fülle von im Blut quantifizierbaren Parametern, die einzeln oder kombiniert in der Diagnostik, Therapiesteuerung und/oder zur Prognoseabschätzung infektiöser Erkrankungen der Lunge und bei Sepsis Anwendung fanden bzw. finden: CRP, Leukozytenmenge, Procalcitonin (PCT), Zytokine und deren Rezeptoren (z. B. IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8), pro-endothelin-1, pro-Adrenomedullin, Nitrit, RBEF (pre-B-cell colony enhancing factor), CXC Chemokine, Surfactantproteine, sTREM-1 (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells -1), suPAR (soluble urokinase-type plasminogen activator receptor), MIF (cytokine macrophage migration inhibitory factor), Wachstumsfaktoren (prostaglandin derived growth factor [PDGF], colony stimulating factor [CSF] tissue growth factor [TGF]), Lipopolysaccharid bindendes Protein (LBP), metabolische Marker (z. B. Colsterin) und BNP oder Quotienten zweier verschiedener Marker (z. B. IL-6/TNFα) [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97].

Marker mit der bei der Pneumonie höchsten Wertigkeit für Prognose und Therapiesteuerung sind PCT, CRP und Leukozytenmenge [95]. In der CAPNETZ-Studie lagen bei den 70 (4,2 %) verstorbenen CAP-Patienten die PCT-Plasmaspiegel signifikant über denen derer, die in dem 28-tägigen Beobachtungszeitraum nicht verstarben. PCT korrelierte ferner mit der Erkrankungsschwere und hatte einen mit dem CRB-65-Index vergleichbaren Vorhersagewert. Die prognostische Wertigkeit von CRP und Leukozytenhöhe lag dagegen im Vergleich signifikant niedriger [90]. Die PCT-kontrollierte Therapie, in der erst ab einem Plasmaspiegel ≥ 0,25 µg/l Antibiotika erlaubt waren, führte im Vergleich zum Standardvorgehen zu einer Reduktion der Verschreibungsrate von 72 %, bei einem jedoch vergleichbaren Therapieerfolg [98]. In einer anderen Studie konnte unter einer PCT-Therapiesteuerung der Antibiotikaverbrauch bei Patienten mit entweder einer CAP, einer COPD, einem Asthma oder anderen Infektionen der Atemwege und der Lunge um ca. 50 % gesenkt werden, ohne dass es zu einer Verschlechterung des klinischen Erfolges kam [99]. Bei an einer Sepsis verstorbenen Patienten lag der PCT-Wert signifikant über den Werten derjenigen, die überlebten (19,2 vs. 2,4 ng/ml, p = 0,001). Etwas weniger deutlich fielen die entsprechenden Unterschiede der Plasma-sTREM-Werte aus (Verstorbene 94 pg/ml vs Überlebende 154 pg/ml, p = 0,02) [92]. CRP diskriminierte nicht zwischen diesen beiden Gruppen.

Für die Entscheidung für oder gegen eine Antibiotikatherapie bei einer Infektion der unteren Atemwege wurden folgende PCT-Grenzwerte vorgeschlagen [96] [97] [98]:

• PCT < 0,1 µg/l: keine Antibiotika

• PCT 0,1 – 0,49 µg/l: Antibiotika nur, wenn durch andere Befunde begründbar

• PCP ≥ 0,5 µg/l: Antibiotikatherapie

Gründe für falsch zu hohe, z. B. bei akuter Niereninsuffizienz oder nicht bakteriellen Infektionen, oder falsch zu niedrige Werte, z. B. sehr frühe oder lokalisierte Entzündungsprozesse, sind dabei allerdings zu beachten [100].

Je nach Studie und Erkrankung korrelieren auch die anderen der o. g. zahlreichen Surrogatparameter mehr oder weniger mit dem Erkrankungsstatus der Hospital-Pneumonie (HAP = hospital aquired pneumonia), der Sepsis, aber auch der CAP sowie dem Therapieerfolg und ermöglichen einen Einblick in die zugrunde liegende Pathophysiologie des Entzündungsgeschehens. Manche haben alleine oder in Kombination mit den klinischen Parametern einen prognostischen Aussagewert. So zeigt z. B. ein hoher PSI (pneumonia severity index; PSI) in Kombination mit erhöhten BNP-Werten (> 279 pg/ml) ein erhöhtes Risiko an, an einer CAP zu versterben oder ein Therapieversagen besser an, als die jeweiligen Parameter alleine [93]. Trotz dieser und anderer positiver Publikationen erlangten die meisten dieser Marker gegenüber den ohnehin zur Verfügung stehenden klinischen Parametern (s. o.; aber auch Beatmungsparameter, Körpertemperatur, radiologische Bildgebung) keine nennenswerte Bedeutung im täglichen Management der betroffenen Patienten [91] [101]. Etabliert sind CRP, Leukozytenmenge und vor allem PCT.

Tuberkulose

Die jetzt zur Verfügung stehenden Interferon-γ-Tests beruhen auf aus dem Patientenblut isolierten Lymphozyten, die in vitro mit Tuberkuloseoberflächenantigen exponiert werden. Das von diesen Zellen freigesetzte Interferon-γ wird in einem Immunoassay quantifiziert. Lymphozyten von Patienten, die mit diesen Tuberkuloseantigenen Kontakt hatten, weisen typischerweise eine erhöhte Interferon-γ-Freisetzung auf. Es wird somit die zellvermittelte Immunantwort gegen drei Tuberkulose-Antigene bestimmt. Die Indikationen für diesen Test sind [102]:

1. Diagnostik einer Mycobacterium tuberculosis Infektion (aktiv und latent)

2. Screening von Kontaktpersonen

3. Ausschluss einer latenten Tuberkuloseinfektion, z. B. bei Patienten, die mit Immunsuppressiva oder TNFα-Antikörpern therapiert werden müssen.

Der Interferon-γ-Test besitzt die Vorteile, dass keine Kreuzreaktion mit einer BCG-Impfung oder nicht tuberkulösen Mykobakterien auftreten und dass er mit einer Spezifität von bis zu ≥ 95 % und einer Sensitivität von ≥ 90 % für eine aktive oder latente Tuberkuloseinfektion spezifischer und sensitiver als der Tuberkulin-Hauttest (Hauttest < 70 %) ist [103]. Vorausgesetzt, es liegt kein Immundefekt vor, schließt ein negativer Test durch die fehlende Immunreaktion gegenüber Tbc-Antigenen eine stattgehabte Tuberkulose praktisch aus. Ein negativer Interferon-γ-Test bei positivem Tuberkulin-Hauttest könnte für eine latente Tuberkulose sprechen [104] [105]. Allerdings ergeben sich auch einige Einschränkungen. So erlaubt der Test keine Aussage zur Aktivität, d. h. es kann nicht zwischen einer latenten Infektion und einer aktiven Tuberkulose unterschieden werden. Bei Lymphopenie, angeborenen oder erworbenen Immundefekten einschließlich HIV und medikamentöser Immunsuppression sowie bei Kindern unter 2 Jahren ist die Sensitivität des Tests herabgesetzt [106]. Unverändert gilt für den Tuberkulosenachweis das kulturelle Ergebnis als der diagnostische Goldstandard. Der Interferon-γ-Test ersetzt nicht die anderen bei der Tuberkulosediagnostik erforderlichen Untersuchungen, wie z. B. die radiologische Bildgebung, die Mikrobiologie, sondern unterstützt diese [107] [108]. Der Test ist nicht zum Nachweis der nicht tuberkulösen Mykobakteriose geeignet.

Ungeachtet dieser Testverfahren wird die aktive Infektion mittels mikroskopischen Nachweises säurefester Stäbchen, z. B. im Sputum oder in der Biopsie ([Abb. 4]), und dem kulturellen Nachweis geführt [109].

Abb. 4 Käsige Nekrose einer Lungentuberkulose mit Zellresten (blau) und säurefesten Stäbchenbakterien (Mykobacterium tuberculosis, Pfeile); Ziehl-Neelsen, × 250.

Erst im positiven Fall ergibt sich die Indikation zur antituberkulösen Therapie [107] [110].

Interstitielle Lungenerkrankungen

Über 2000 verschiedene interstitielle Lungenerkrankungen (diffuse parenchymale Lungenerkrankungen DPLDs) oder extrapulmonale Erkrankungen (z. B. Sklerodermie, granulomatöse Erkrankungen, Erkrankungen aus dem rheumatischen oder dem autoimmunologischen Formenkreis) sind bekannt, die zu einer direkten oder indirekten Entzündung des Lungenparenchyms führen. Des Weiteren können auch diverse Medikamente (z. B. Amiadaron, einige Immunsuppressiva) oder Stäube (z. B. Asbest, Byrillium) zu einer interstitiellen Lungenentzündung führen [111] [112] [113]. Bei vielen dieser Erkrankungen ist die Ätiologie nicht bekannt [114] [115] [116]. Die Diagnosestellung beruht auf der Anamnese, dem HRCT (high resolution Computertomographie) der Lunge, der Lungenfunktionsprüfung und bei unklaren Fällen auf einer Lungenhistologie [117] [118].

Bei immunologisch ausgelösten DPLDs, insbesondere die Hypersensitivitätspneumonitis (HP; z. B. Farmerlunge), helfen die im Blut bestimmbaren Antigentiter, das auslösende Agens einzugrenzen bzw. zu beweisen und haben neben dem Nachweis einer aktuellen Antigenexposition, rezidivierenden Symptomen, Fibroseknistern bei der Auskultation, Auftreten von Symptomen 4 – 6 Stunden nach Antigenexposition und Gewichtsverlust einen hohen prädiktiven Wert für eine klinische Verschlechterung (OR 5,3, 95 % CI 2,7 – 10,4) [119]. In der Vergangenheit wurde auch bei anderen DPLDs Biomarker im Blut untersucht. Bei der Sarkoidose korrelieren z. B. der erhöhte lösliche IL-2-Rezeptor und Neopterin mit der Schwere der Sarkoidose [120]. Symptomatische Sarkoidose-Patienten weisen vergleichbar erhöhte Serum-ACE (angiotensin converting enzyme)-Spiegel auf, die mit einer Erhöhung des Propeptids des Typ-I-Prokollagens in der BAL korrelierten [121]. Eine ACE-Serumerhöhung ist aber nicht für eine Sarkoidose beweisend. Bei der IPF wurde ACE-2 dagegen eine prädiktive Funktion zugeschrieben [122]. Weitere bzgl. einer prognostischen und diagnostischen Wertigkeit untersuchte Serummarker waren z. B. Metalloproteinasen, Oxidantien und Oxidationsprodukte, Antioxidantien, Serum-KL-6 (MUC1 mucin), Surfactantprotein-A und -D, Laktatdehydrogenase, CYFRA-16 (Cytokeratin-19), Zytokeratin-18 und anti-Zytokeratin-18 Antikörperimmunkomplexe oder MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) [123] [124] [125] [126] [127].

Das Ergebnis der BAL hat in der Diagnostik interstitieller Lungenerkrankungen nur unterstützenden Wert. Einen prädiktiven Wert besitzt sie nicht, hat aber unser pathophysiologisches Verständnis der untersuchten Erkrankungen vertieft [117] [128] [129].

Es gibt bzgl. der DPLDs keinerlei Biomarker, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt einen für die Praxis nennenswerten diagnostischen, therapeutischen oder prognostischen Wert besitzen. Ob in Zukunft die Analyse von Proteinnetzwerken (proteomics) weiterhilft, wie unlängst diskutiert, bleibt abzuwarten [130] [131].

Lungenembolie

Obwohl die meisten Patienten mit akuter Lungenembolie (LE) eine gute Prognose aufweisen, übersteigt die Gesamtmortalität nach 3 Monaten 15 %. Während der ersten 30 Tage nach Diagnosestellung stellt das akute Rechtsherzversagen die häufigste Todesursache dar und die spätere Mortalität ist oft durch zugrunde liegende Krankheiten wie Herzinsuffizienz, Tumorleiden oder chronische Lungenerkrankungen bedingt [132].

Die Risikostratifizierung ist nicht nur hilfreich, um die initiale Therapie festzulegen, sondern auch entscheidend für das Langzeit-Management. Ausgewählte Patienten können von der systemischen Thrombolyse oder der chirurgischen Embolektomie profitieren [133]. Die akkurate Risikoeinschätzung hilft auch diejenigen Patienten zu identifizieren, die ein erhöhtes Risiko der Entwicklung einer chronisch-thromboembolischen pulmonalen Hypertonie aufweisen.

Die Diagnosestellung und Risikostratifizierung der Lungenembolie umfasst folgende diagnostische Schritte [134]:

1. die klinische Beurteilung: klinische Zeichen der Rechtsherzbelastung, Hypotonie, Halsvenenstauung, Herztöne/pathologische Herzgeräusche infolge Trikuspidalinsuffizienz,

2. EKG: Tachykardie, T-Wellen-Inversion, Qr in V1,

3. Echokardiografie: Thrombennachweis (histologisches Korrelat in [Abb. 5]), Quantifizierung der Rechtsherzbelastung/rechtsventriukärer Dysfunktion, Abklärung wichtiger Differentialdiagnosen (z. B. Aortendissektion, Perikardtamponade, offenes Foramen ovale),

4. CT des Thorax: Thrombennachweis ([Abb. 6]), Pneumonienachweis, Abklärung wichtiger Differenzialdiagnosen und

5. Biomarker [135]: D-Dimere, Troponin I und T, NT-pro brain natriuretic peptide (NT-proBNP) und BNP

Abb. 5 Verschluss eines Pulmonalarterienastes (links) durch einen Thrombembolus (Pfeil) umgeben von einem panacinären Emphysem; v. Gieson, × 10.

Abb. 6 Embolus in der A. pulmonalis (Pfeil).

Die Höhe des Troponin-Spiegels korreliert bei der akuten Lungenembolie mit dem Ausmaß der rechtsventrikulären Dysfunktion. Als Pathomechanismus der Troponin-Freisetzung wird eine Mikro-Myokardnekrose infolge eines Missverhältnisses zwischen dem erhöhten Sauerstoffbedarf des druckbelasteten rechten Ventrikels und dem aktuell geringen Sauerstoffangebot angenommen. Der negative prädiktive Wert für die Krankenhausmortalität bei niedrigen Troponinwerten beträgt 97 % [136].

Wie auch bei der COPD-Exazerbation erhöhen sich die Plasma NT-proBNP und BNP-Werte bei einer Rechtsherzbelastung. Erhöhte Plasmawerte sind mit einer gesteigerten Krankenhausmortalität assoziiert [137]. Der negative prädiktive Wert für die Krankenhausmortalität beträgt 99 % für die NT-proBNP und BNP, d. h. niedrige Werte schließen ein erhöhtes Risiko aus. Die cut-off-Werte liegen allerdings niedriger (z. B. BNP 50 pg/ml) als die cut-off-Werte für die Herzinsuffizienz (z. B. BNP 90 pg/ml). Durch die möglichen kardialen, pulmonalen und vielen anderen Differenzialdiagnosen, wie z. B. Leukämien, Sepsis, Tumore (vor allem Ovarialkarzinom, Lungentumore), Komplikationen während der Schwangerschaft und selbst körperlicher Stress, haben erhöhte Messwerte für die Lungenembolie keine diagnostische Bedeutung [50].

Aus quervernetztem Fibrin spaltet Plasmin, unter der Wirkung von Faktor XIII, Dimere strangversetzter Bruchstücke des Fibrins ab, sogenannte D-Dimere, welche die D und E Sequenz enthalten. Diese werden anschließend mit einer physiologischen Halbwertszeit von ca. 8 h weiter abgebaut [138]. Der Nachweis von D-Dimere erlaubt also keine Differenzierungsmöglichkeit bezüglich der Lokalisation des Thrombus, sondern zeigt lediglich eine Fibrinolyse und damit alle Krankheitszustände mit gesteigerter Gerinnungsaktivierung an. Negative D-Dimere schließen bei entsprechendem klinischen Verdacht eine Pulmonalembolie mit fast 100 %iger Wahrscheinlichkeit aus. Dieser hohe negativ prädiktive Aussagewert hilft, in der Praxis eine aufwendige Lungenemboliediagnostik zu reduzieren [139]. Bei kleinen peripheren Pulmonalembolien ([Abb. 5]) sinkt die Sensitivität allerdings auf 70 % [138].

Nordenholz et al. testeten bei Patienten mit einer Lungenembolie oder einer tiefen Beinvenenthrombose 50 weitere Biomarker und fanden, dass lediglich D-Dimere, CRP und die Myeloperoxidase (MPO) eine gewisse diagnostische Aussage für das Vorliegen einer Lungenembolie besitzen [140]. Bei einem Grenzwert von ≥ 500 ng/ml betrug die Sensitivität und Spezifität von D-Dimere für das Vorliegen einer Lungenembolie oder einer Venenthrombose 100 %, womit eine frühere Studie, die den gleichen Grenzwert untersuchte, bestätigt wurde [141]. Die Kombination negativer D-Dimere oder einem MPO-Wert von < 22 mg/dl nicht aber CRP sagten mit einer Sensitivität von 100 % und einer Spezifität von 73 % ein negatives Ergebnis in der Pulmonalisangiografie voraus [142].

Biomarker: ein kleiner Blick in die Zukunft

Biomarker sind aus der medizinischen Diagnostik und zur besseren Therapiesteuerung nicht mehr wegzudenken. Manche besitzen einen prognostischen Wert. Die meisten Marker eignen sich allerdings als diagnostische und die Therapie leitende Surrogatparameter nicht, da Sensitivität und/oder Spezifität nicht beschrieben oder zu schlecht sind. Auch in der Pneumologie wird unverändert nach Surrogatparametern gesucht, die uns zusätzliche verlässlichere Aussagen über die Patienten ermöglichen und die eine hohe Korrelation mit den uns zur Verfügung stehenden diagnostischen Parametern besitzen ([Abb. 7]).

Abb. 7 Auswahl von Biomarkern, deren Beziehung zur Quelle und dem Bezug zur Klinik. QoL = Lebensqualitätsfragebogen (quality of life questionnaire), IL- = Internleukine, FeNO = exhaliertes Stickstoffmonoxid, CO = Kohlenmonoxid.

Wissenschaftlich interessant ist diesbezüglich die Entwicklung bei Parametern aus der Ausatemluft und dem Atemkondensat.

Atemkondensat

Aus diversen methodischen Gründen hat sich die Hoffnung, durch die Bestimmung von Atemkondensatmarkern eine genauere Diagnostik und therapeutische Erfolgskontrolle bei entzündlichen, allergischen, malignen, degenerativen und durch Umwelteinflüsse bedingten Atemwegs- und Lungenerkrankungen zu erzielen, bis heute nicht erfüllt [27] [143] [144]. Folgende Ansätze werden zur Zeit in wissenschaftlichen Studien verfolgt:

• Proteine: Die Erstellung von Proteinprofilen (proteomics) ermöglicht auf der translationalen Seite die Untersuchung von Proteinnetzwerken, wie sich diese im Zellmetabolismus und letztendlich auf die Entstehung von Krankheiten auswirken. Die Charakterisierung von Proteinnetzwerken im einfach zu gewinnenden Atemkondensat, aber auch im Sputum oder in der BAL böte sich als Methode zur Erweiterung unseres pathophysiologischen Verständnisses von benignen und malignen Atemwegs- und Lungenerkrankungen und/oder zur Diagnostik an [145] [146] [147].

• DNA-Mikrosatelliten (MSs): MSs sind die häufigsten intergenetischen DNA-Sequenzen, die sich im eukariontischen Genom als minimal repetitive Sequenzen (meist ein bis fünf Basenpaare) wiederholen. Da das Ausmaß der MSs-Instablität mit hohen Genmutationsraten korreliert, eignen sie sich zur Identifizierung von sich potenziell verändernden Genregionen [148] [149]. Im Exhalat gemessene MSs-Instabiltät lag bei Patienten mit einem Asthma, einer COPD oder malignen Erkrankungen im Vergleich zu Gesunden höher [150] [151].

Elektronische Nase

Die s. g. elektronische Nase bildet basierend auf elektronischen Signalen einen digitalen Fingerabdruck der in der Luft enthaltenen Moleküle. Die elektrische Signalstärke von mehreren Sensoren (Sensor- oder Chemosensor-Arrays) wird mathematisch verarbeitet und als Mustererkennung wiedergegeben. Einzelne Stoffe oder Stoffgruppen können nicht erkannt werden, sondern nur Muster der molekularen Zusammensetzung der analysierten Luft oder volatile organic compunds (VOCs). Die VOCs der exhalierten Luft kann bei bestimmten Erkrankungen ein charakteristisches Muster aufweisen und so z. B. auf ein Malignom oder ein Asthma hinweisen [152] [153] [154] [155]. Die Messung ist simpel, da der Patient lediglich in ein Gerät einatmen muss, das je nach Hersteller nur die Größe einer Flasche besitzt. Durch die fehlende Validierbarkeit, die Fülle an Einflussgrößen und die schwierige Interpretierbarkeit der Ergebnisse eignet sich diese Methode (noch) nicht für die Routine [156].

Spektrometrie

Spektrometrische Analysen erlauben die Quantifikation von Spurengasen und in der Luft befindlichen Komponenten/Molekülen [157]. Gaschromatographische Profile und die (massen-)spektrometrisch gemessenen exhalierten Moleküle, wie z. B. Methylfurane können zwischen aktiven, passiven und Nichtrauchern unterscheiden [158] [159]. Wie auch bei der elektronischen Nase sind die methodischen Einflussgrößen groß. Durch die ausgesprochene Empfindlichkeit und Sensitivität ergeben sich aber auch Störfaktoren seitens des Patienten und der mitgemessenen Umgebungsluft, da kleinste Veränderungen das Detektionsmuster grundlegend ändern können, was auch für die ebenfalls in Entwicklung befindliche Nuklearmagnetresonanz-Messung gilt [21].

Interessenkonflikte

A. Gillissen, W. Wiechmann und U. R. Jürgens erklären, dass bezüglich des Artikelinhalts bei keinem ein Interessenkonflikt mit der pharmazeutischen Industrie oder sonstigen Dritten besteht.

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