Comparação de preparações de enxertos ósseos para tratamento de defeitos ósseos críticos em um modelo animal roedor

Palavras-chave

modelos animais - osso e ossos - regeneração óssea - transplante ósseo

Introdução

A incidência de defeitos ósseos tem aumentado e exige soluções.[1] [2] [3] Essas lesões têm profundos impactos econômicos e clínicos; além disso, os desfechos do tratamento são limitados pelas altas taxas de complicações.[4] [5] [6] O enxerto ósseo autólogo é o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos por ser fácil de obter, combinar propriedades e não induzir respostas imunes ou transmitir infecções.[7] [8] [9] No entanto, não se sabe a técnica de enxerto ósseo autólogo mais eficaz.[10] [11]

Um defeito ósseo de tamanho crítico é um defeito ortotópico que não cicatriza sem intervenção[12] [13 ]ou o defeito tecidual de menor tamanho que não cicatriza por completo ao longo da vida.[12] [14] No modelo de crânio de rato, defeitos maiores que 5 mm são considerados críticos.[15] [16] [17]

A pedra angular do desenvolvimento pré-clínico de tecnologias translacionais é a reprodutibilidade confiável, análoga à condição clínica investigada em modelos animais.[12] [18] Desenvolvemos um modelo animal de defeito ósseo crítico em crânios de ratos e seu tratamento com diferentes técnicas de enxerto ósseo. A regeneração óssea foi avaliada em diferentes tempos por histomorfometria, nanotomografia computadorizada (nTC), densitometria óssea e testes biomecânicos.

Este estudo comparou diferentes técnicas de tratamento de defeitos ósseos críticos no crânio de ratos com enxertos ósseos autólogos locais.

Materiais e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética animal de nossa instituição sob número de protocolo CEUA 120/2019.

Ratos Wistar machos com 7 semanas de idade, pesando 200 g (± 10 g) foram obtidos do biotério central de nossa instituição e alojados em gaiolas individuais com enriquecimento ambiental em sala com condições controladas de umidade (55 a 60%), temperatura (23 ± 1 C) e ciclo claro/escuro artificial de 12 horas. Os procedimentos experimentais começaram depois que os espécimes atingiram a maturidade, com 300 g (±10 g) e 10 semanas de idade.

Cento e oito (108) ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (36 animais por grupo): (1) grupo simulado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio (7 mm de diâmetro); (2) grupo macerado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio tratados com enxerto ósseo autólogo local macerado; (3) grupo picado: ratos com defeito ósseo crítico no crânio tratados com enxerto ósseo autólogo local picado. Os procedimentos experimentais (primeiras cirurgias e cirurgias de eutanásia) foram realizados ao mesmo tempo, pelo mesmo cirurgião e nas mesmas condições para minimizar vieses.

Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados e resfriados à temperatura ambiente (23 C). A mesa cirúrgica e os instrumentos foram esterilizados com etanol a 70%.

Todos os ratos foram anestesiados por injeção intramuscular (IM) de Cetamin® da Syntec (cloridrato de cetamina 10%, 60 mg/kg) e Xylazin® da Syntec (cloridrato de xilazina 2%, 7,5 mg/kg) e tricotomizados da ponte nasal até a extremidade distal do crânio. Um cotonete foi utilizado para retirada de aparas de pelos e Lacrilube® da Allergan Inc. foi aplicado em cada olho. O crânio foi pintado com iodo. Um campo cirúrgico estéril foi colocado com uma abertura redonda acima do crânio.

Uma incisão longitudinal de 1,5 cm da pele superficial foi estendida até o periósteo sobre o crânio, do osso nasal até caudal à crista sagital média ou bregma. O periósteo foi dividido ao meio com o bisturi por meio de uma linha média sagital, elevando-o do crânio. Um afastador automático retraiu os tecidos moles e expos o osso subjacente.

Uma área alvo centralizada na intersecção das duas linhas médias do crânio anteroposterior, de lado a lado, foi desenhada. Uma broca Strong® Micro Motor 210/105L e uma trefina Zipperer® (7 mm de diâmetro total) fixadas marcaram o topo do crânio a 1.500 rpm, com aplicação de salina estéril em gotas (uma gota a cada 2 segundos) para evitar lesão térmica. A broca foi manuseada com leve pressão contra a superfície do crânio para produzir o defeito. Um elevador foi utilizado na margem da osteotomia completando o defeito. O mesmo elevador foi usado para levantar o cilindro do osso, liberando a dura-máter da parte inferior e puxando o osso para fora ([Fig. 1]).

Fig. 1 Etapas técnicas da primeira cirurgia.

O defeito foi lavado com solução salina para remoção de detritos antes do enxerto ([Figs. 2] e [3]). O periósteo foi fechado com sutura contínua e a pele recebeu sutura simples com categute. Os ratos foram colocados sob observação quanto a quaisquer sinais de movimento proposital e depois transferidos para as gaiolas normais de criação.

Fig. 2 Preparação de enxerto ósseo macerado para preenchimento do defeito crítico.

Fig. 3 Preparação de enxerto ósseo picado para preenchimento do defeito crítico.

Os cuidados pós-operatórios diários foram compostos por avaliação de saúde, incluindo exame de feridas, prevenção de sofrimento, observação neurológica e analgesia otimizada. Todos os animais foram tratados com tramadol (25 mg/kg) por via subcutânea duas vezes ao dia durante 3 dias para evitar dor pós-operatória. As gaiolas foram limpas e a água/comida trocada três vezes por semana. Os ratos tiveram suas massas corporais registradas uma vez por semana. Os grupos foram acompanhados no pós-operatório e cada um deles foi separado em três subgrupos de acordo com a análise do desfecho, às 3, 6 e 12 semanas após a cirurgia.

Os ratos dos três grupos foram eutanasiados em três momentos diferentes, às 3, 6 e 12 semanas após as cirurgias. O método de eutanásia utilizado foi a injeção intramuscular de overdose anestésica de Cetamin® e Xylazin®.

Procedimentos iniciais semelhantes foram realizados com acesso cirúrgico um pouco maior (2,5 cm) centrado na incisão anterior. Um segmento retangular do crânio do rato foi delimitado e seccionado com disco serrilhado SDT® de granulometria fina 19/0,15 mm a 9.000 rpm acoplado ao mesmo Strong® Micro Motor 210/105L. Os fragmentos de crânio contendo o defeito ósseo crítico circundado por osso craniano original, com tamanho médio de 15,01 × 11,85 mm, foram coletados ([Fig. 4]).

Fig. 4 Retângulo do crânio obtido após a eutanásia.

Um total de 58 amostras foram destinadas à histologia e fixadas com paraformaldeído a 4% frio, enquanto as outras 57 amostras foram fixadas com álcool a 70% para avaliação de densitometria óssea, nTC e testes mecânicos.

A rotina de descalcificação com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 10% frio, desidratação progressiva com concentrações crescentes de álcool, clarificação em xilol em três trocas e emblocamento em parafina foi realizada no Laboratório de Histologia de nossa Instituição. Após a inclusão em parafina, cortes de 5 mm foram obtidos e colocados em lâminas histológicas carregadas (Manco Inc., EUA). A coloração dos cortes coronais utilizou hematoxilina e eosina (HE). Um microscópio de campo claro (Axiovert; Carl Zeiss®, Alemanha) foi utilizado para análise das lâminas. Uma câmera CCD (AxioCam MRc; Carl Zeiss®, Alemanha) capturou imagens com diversas ampliações para interpretação posterior ([Fig. 5]). No total, 500 lâminas histológicas foram produzidas com essas 58 amostras.

Fig. 5 Fotomicrografias: 1A, grupo simulado; 1B, grupo macerado; 1C, grupo picado (12 semanas após a cirurgia).

A análise de densitometria óssea foi realizada nas 57 amostras de crânio contendo o defeito ósseo crítico por absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) usando um densitômetro Lunar® DPX-IQ (Lunar®; software versão 4.7e, GE Healthcare®, Reino Unido). Uma região de interesse (ROI) de aproximadamente 49 mm² foi utilizada para avaliação da nova formação óssea. A densidade mineral óssea (BMD, g/cm²) e o conteúdo mineral ósseo (BMC, g) foram medidos conforme protocolo.

As amostras de DXA foram então organizadas e escaneadas com Nano tomograph Phoenix v|tome|x s – General Electric® ([Fig. 6]). As imagens de cada espécime foram reconstruídas com software específico (Dataviewer 1.5.1.2 64 bits - SkyScan® Bruker®) e analisadas por CTAn (CTAn v.1.15.4.0 64 bits - SkyScan® Bruker®) para determinar parâmetros morfométricos nas ROIs selecionadas. Todos os parâmetros morfométricos estão de acordo com a nomenclatura da American Society for Bone and Mineral Research (ASBMR): volume ósseo (BV), volume ósseo percentual (BV/TV), relação superfície/volume ósseo (BS/BV), índice de modelo de estrutura (SMI), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N), separação trabecular (Tb.Sp), porcentagem de porosidade total (Po tot) e densidade de conectividade (Conn.Dn).

Fig. 6 Aparência nanotomográfica dos grupos simulado, picado e macerado.

As 57 amostras de crânio foram tensionadas mecanicamente em um teste de perfuração do tipo push-out. Os testes de estresse de defeitos ósseos críticos ocorreram em equipamento universal com célula de carga de 50 N (Trd 28–EMIC DL 10000®). As configurações dos testes foram velocidade de progressão de 1 mm/min, pré-carga de 1 N e tempo de acomodação de 30 s. A amostra óssea foi posicionada sobre um suporte metálico customizado com furo circunferencial de 8 mm de diâmetro centralizado e alinhado com o centro do defeito ósseo crítico. Um empurrador metálico cilíndrico com 7 mm de diâmetro também centrado e alinhado com o defeito ósseo e o centro do furo circunferencial de suporte desceu gradativamente até entrar em contato com as amostras, pré-carregar e então tensionar gradativamente as amostras com ou sem enxerto até o rompimento completo ([Fig. 7]). Utilizando o script do software Tesc 3.04, os dados brutos foram filtrados e medidas de força máxima, deformação, rigidez relativa e resistência máxima de elasticidade. As amostras foram hidratadas com solução salina durante os testes.

Fig. 7 Testes mecânicos de diferentes ângulos e em detalhes.

Os testes de hipóteses analisaram a variação na regeneração óssea com as diferentes técnicas de enxerto ósseo em comparação com o grupo simulado. Todas as variáveis foram testadas quanto à normalidade com base no histograma visual e no teste de Shapiro-Wilks. A estatística descritiva utilizou a mediana e o desvio absoluto da mediana (MAD) como medidas de tendência central e dispersão, respectivamente. Aplicou-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste post-hoc de Dunn para comparação múltipla de Kruskal-Wallis. O índice de correlação de Spearman foi calculado para analisar a relação entre os múltiplos parâmetros obtidos por nTC, densitometria óssea e testes de estresse. Todas as análises estatísticas foram realizadas em R para Linux/GNU versão 4.1.0 e o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Uma análise histológica qualitativa evidenciou maior proporção de neoformação óssea no defeito ósseo crítico dos grupos enxertados em comparação ao grupo simulado. Além disso, a análise qualitativa de microscopia de campo claro sugeriu que o grupo picado induzia a maior formação óssea de todas.

Da mesma forma, a análise quantitativa comprovou o maior percentual de osso novo formado nos grupos picado e macerado em comparação ao grupo simulado (p = 0,008). Embora o grupo picado tenha apresentado os maiores percentuais de neoformação óssea, a diferença com o grupo macerado não foi estatisticamente relevante (p = 0,1) ([Fig. 4]). Acreditamos que essa tendência mereça atenção.

Observamos um aumento geral significativo na BMD ao comparar os diferentes períodos de desfecho (p < 0,001) ([Tabela 1]). Três semanas após o procedimento, a mediana da BMD foi de 0,01 (MAD = 0,001) no grupo simulado, 0,026 (MAD = 0,001) no grupo macerado e 0,041 (MAD = 0,0007) no grupo picado (p = 0,0004). As diferenças persistiram às 6 e 12 semanas (p = 0,0004 e p = 0,0002, respectivamente). No grupo simulado, a BMD mediana foi de 0,0085 (MAD = 0,0007) e 0,03 (MAD = 0,001) às 6 e 12 semanas, respectivamente. No grupo macerado, a BMD mediana foi 0,0185 (MAD = 0,0007) e 0,04 (MAD = 0,001) e, no grupo picado, a BMD mediana foi 0,031 (MAD = 0,002) e 0,054 (MAD = 0,001) às 6 e 12 semanas, respectivamente ([Fig. 8]). O teste post-hoc para comparação pareada demonstrou o incremento na regeneração óssea no grupo picado em comparação ao grupo simulado.

Fig. 8 Concentração mineral óssea (BMC) e densidade mineral óssea (BMD) por grupos e tempos.

Tabela 1

Variável	Semanas	Grupos	Mediana	MAD	Valor de p
BMC	3				0.00038150651248
		Simulado	0,002	0
		Picado	0,009	0,0007413
		Macerado	0,005	0
BMC	6				0,00067991117923
		Simulado	0,0015	0,0007413
		Picado	0,0055	0,0007413
		Macerado	0,003	0
BMC	12				0,00019298618864
		Simulado	0,003	0
		Picado	0,015	0,0014826
		Macerado	0,008	0,0014826
BMD	3				0,00048367583690
		Simulado	0,0105	0,0014826
		Picado	0,0415	0,0007413
		Macerado	0,026	0,0014826
BMD	6				0,00046850172588
		Simulado	0,0085	0,0007413
		Picado	0,0315	0,0022239
		Macerado	0,0185	0,0007413
BMD	12				0,00020323763567
		Simulado	0,03	0,0014826
		Picado	0,054	0,0014826
		Macerado	0,04	0,0014826

Analisamos os parâmetros nTC nos grupos experimentais. O BV e o BV/TV estimam o volume de osso regenerado na área do defeito ósseo crítico. Observamos uma regeneração óssea global significativa nos grupos picado e macerado em comparação ao grupo simulado (p < 0.0001) ([Fig. 9]). O BV mediano do grupo simulado às 3, 6 e 12 semanas foi de 1,4 (MAD = 0,2), 3,1 (MAD = 0,35) e 3,3 (MAD = 0,6), respectivamente. No grupo macerado, o BV mediano às 3, 6 e 12 semanas foi de 1,3 (MAD = 0,6), 5,4 (MAD = 2,1) e 4,7 (MAD = 2,3) ([Tabela 2]).

Tabela 2

Variável	Semanas	Grupo	Mediana	Valor de p
BV	3			0,002338
		Simulado	3,166115
		Picado	9,8977
		Macerado	5,39414
BV	6			0,0033992
		Simulado	1,39563
		Picado	6,83119
		Macerado	1,30313
BV	12			0,0013393
		Simulado	3,29243
		Picado	12,90203
		Macerado	4,74866
BV/TV	3			0,0030956
		Simulado	1,60475
		Picado	8,1638
		Macerado	2,360649
BV/TV	6			0,0029369
		Simulado	0,622355
		Picado	6,21231
		Macerado	0,812585
BV/TV	12			0,0003588
		Simulado	1,22118
		Picado	11,49151
		Macerado	4,80795

Fig. 9 Volume ósseo (BV) e volume ósseo por volume total (BV/TV).

Analisamos a correlação entre a BMD e os parâmetros microestruturais obtidos por nTC e detectamos uma alta correlação positiva com BV, BV/TV e Tb.N (rho = 0,77, rho = 0,82 e rho = 0,81, respectivamente), e uma forte anticorrelação com a separação trabecular e a porosidade total (rho = -0,73 e rho = -0,82, respectivamente).

A análise biomecânica inferiu o comportamento da neoformação óssea sob testes de estresse. Medimos a força máxima, a deformação, a rigidez relativa e a resistência máxima à elasticidade de cada amostra de crânio. Observamos que os espécimes de crânio de ratos submetidos ao enxerto com osso picado foram significativamente mais resistentes ao estresse ([Tabela 3]) (p < 0,0001 para todas as variáveis). A força máxima mediana geral (MAD), a deformação, a rigidez relativa e a resistência máxima à elasticidade no grupo picado foram de 36 (19,9), 2,6 (0,8), 12,5 (5,5) e 39,1 (20,5), respectivamente, em comparação a 10,1 (4), 1,39 (0,3), 6,8 (3) e 6,8 (2,8) no grupo simulado e 13,1 (9,2), 1,9 (1), 4,7 (3) e 14,6 (11) no grupo macerado ([Fig. 10]).

Fig. 10 Resistência máxima (N) e deformação (mm).

Tabela 3

Variável	Semanas	Grupo	Mediana	Valor de p
Resistência máxima	3			0,002338
		Simulado	8,375
		Picado	34,54
		Macerado	13,06
Resistência máxima	6			0,006104
		Simulado	11
		Picado	36,77
		Macerado	10,92
Resistência máxima	12			0,003498
		Simulado	10,56
		Picado	35,99
		Macerado	14,075
Deformação	3			0,041776
		Simulado	1,44
		Picado	2,415
		Macerado	2,965
Deformação	6			0,010158
		Simulado	1,32
		Picado	2,565
		Macerado	1,39
Deformação	12			0,014718
		Simulado	1,13
		Picado	2,64
		Macerado	2,185

Discussão

Os defeitos ósseos representam desafios relevantes para os ortopedistas.[1] [2] [3] [4] [19] [20] Os tratamentos de defeitos ósseos críticos muitas vezes geram complicações.[4] [5] [6] Há também uma associação com recuperação prolongada e diminuição da qualidade de vida.[21]

O sucesso do enxerto ósseo é limitado por muitos fatores, como a capacidade de remodelação do hospedeiro, o próprio material, a técnica cirúrgica[22] e até mesmo a forma de manuseio do enxerto.[23] [24] O autoenxerto é o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos, mas ainda não está claro qual técnica de preparo induz maior regeneração.[8] [24] [25] Está bem estabelecido que as dimensões do enxerto influenciam o resultado do tratamento[26] [27] [28]e o crânio já foi descrito como a área doadora,[29] mas, até onde sabemos, não houve um estudo comparando preparações de enxerto ósseo autólogo local macerado e picado.

Do ponto de vista macroscópico e clínico ao microestrutural, nossos dados demonstraram a maior eficiência da preparação do enxerto ósseo picado na indução da regeneração óssea.

Macroscopicamente, detectamos maior massa óssea (densidade e conteúdo) no grupo picado em comparação aos grupos simulado e macerado em todos os desfechos (3, 6 e 12 semanas após a cirurgia). Da mesma forma, nossos testes mecânicos também confirmaram a maior eficácia do enxerto ósseo picado na indução da regeneração óssea com propriedades mais fortes. Vale ressaltar que o grupo picado apresentou ossos recém-formados com maior força máxima, rigidez e deformação, exigindo cargas maiores antes da falha e demonstrando maior módulo de elasticidade. Histologicamente, nossa análise qualitativa sugere uma porcentagem muito maior de formação óssea tecida e preenchimento de defeitos ósseos críticos nas amostras do grupo picadas do que no grupo macerado, o que pode ser confirmado microscopicamente pela avaliação por nTC. O grupo picado exibiu um efeito osteogênico notável no aumento dos parâmetros relacionados à formação de volume ósseo e fração óssea, densidade de conectividade, espessura e número trabecular, além de diminuições nos parâmetros relacionados à reabsorção, como relação superfície/volume ósseo, índice de modelo de estrutura, separação trabecular e porosidade.

É importante destacar que modelos de defeito ósseo crítico no crânio de ratos podem ser usados para o estudo de regeneração óssea e biomateriais antes de considerar animais maiores ou futuras aplicações humanas.[30] O primeiro modelo de defeito ósseo no crânio de ratos foi descrito em 1973 por Freeman e Turnbull, mas realizado por Takagi e Urist somente em 1982. Confirmamos a eficácia do nosso modelo, pois não houve regeneração óssea espontânea no grupo simulado em qualquer desfecho.

Dentre as limitações do nosso estudo, podemos incluir a falta de elucidação dos mecanismos que levam a uma melhor regeneração óssea devido ao uso do enxerto ósseo picado. Embora não tenha sido o objetivo do nosso estudo, pesquisas futuras devem incluir avaliação molecular para expandir nossa capacidade crítica e a produção científica de dados, bem como direcionar terapias farmacológicas potentes para induzir ainda mais a regeneração. A comparação entre enxerto ósseo autólogo local, enxerto ósseo autólogo distante e substitutos ósseos adjuvantes deve ser mais investigada nos processos de cicatrização óssea para alcançar o melhor tratamento possível para defeitos ósseos críticos.

Conclusão

Este estudo evidenciou que diferentes técnicas para preparo e tratamento local de defeitos ósseos podem desempenhar um papel importante na indução da regeneração óssea. Utilizamos um modelo animal de defeito ósseo sem cicatrização espontânea durante todo o experimento. Por outro lado, nossos protocolos de enxerto ósseo autólogo local induziram regeneração óssea neste modelo animal. O enxerto ósseo picado gerou ossos recém-formados com maior massa, melhor microarquitetura e melhor integridade mecânica do que os ossos recém-formados após o enxerto ósseo macerado.

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