Beeinflussung der Stimulus-Sekretions-Kopplung von isolierten Pankreasinseln durch eine kurze Zellkulturphase

Hintergrund und Ziel: Der Isolierung von Pankreasinseln mittels Kollagenaseverdau wird derzeit routinemäßig eine Zellkulturphase nachgeschaltet, von der eine Erholung („recovery“) angenommen wird, die erst reproduzierbare und relevante Ergebnisse ermöglichen soll. Es ließen sich jedoch reproduzierbare Unterschiede in der Glucose-stimulierten Insulinsekretion zwischen frisch isolierten und kultivierten Inseln zeigen, während rein depolarisierende Stimuli keine Unterschiede erbrachten. Es ist daher wichtig, die zugrunde liegenden Mechanismen zu kennen, um die Validität der an unterschiedlichen Modellen gewonnenen Beobachtungen einzuschätzen.

Methode: NMRI-Mausinseln wurden durch Kollagenase-Injektion in den Pankreasgang isoliert und frisch oder kultiviert in RPMI+10% FBS (5 mM Glucose) verwendet. Die Insulinsekretion wurde durch Umströmung mit Krebs-Ringer Medium (KR-Medium, 5 mM Glucose) und ELISA des fraktionierten Eluats gemessen. Die mitochondriale Funktion wurde durch die Messung der NAD(P)H- und FAD-Autofluoreszenz und der TMRE-Fluoreszenz als Indikator des mitochondrialen Membranpotentials bestimmt.

Ergebnisse: Zunächst wurde die Reaktion von frisch isolierten Inseln mit der Reaktion von Inseln verglichen, die zuvor für 3 Stunden kultiviert worden waren. Als Stimulus diente eine maximal effektive Glucosekonzentration (30 mM Glucose) nach einer Umströmung ohne Glucose für 60 min. Die frisch isolierten Inseln zeigten nach einer Latenz von 10 min eine kontinuierlich ansteigende deutliche Insulinsekretion, die bei Auswaschen schnell auf den prästimulatorischen Wert zurückging. Die kultivierten Inseln zeigten auf den Glucosestimulus keinen Anstieg der Sekretion, jedoch einen signifikanten Anstieg mit dem Auswaschen. In beiden Präparationen kam es durch 30 mM Glucose zu einem Anstieg der NAD(P)H- und einem Abfall der FAD-Fluoreszenz. Diese waren in den kultivierten Inseln stärker ausgeprägt und nur hier war ein signifikanter Anstieg des mitochondrialen Membranpotentials zu verzeichnen. Wurde das Umströmungsprotokoll mit Inseln durchgeführt, die zuvor entweder für 3 Stunden mit KR-Medium oder 3 Stunden mit Zellkulturmedium umströmt wurden, war die stimulierte Sekretion der KR-umströmten Inseln gegenüber frisch isolierten Inseln unverändert, die mit Zellkulturmedium umströmten Inseln zeigten eine gesteigerte Sekretion gegenüber den statisch kultivierten Inseln.

Schlussfolgerung: Inseln, die mit Zellkulturmedium in Kontakt waren (statisch oder umströmt) zeigen eine andere Sekretionskinetik als Inseln, die nur mit KR-Medium in Kontakt waren. Dabei reagiert der mitochondriale Stoffwechsel qualitativ gleichartig, jedoch ist bei den KR-exponierten Inseln kein Anstieg des mitochondrialen Membranpotentials zu verzeichnen. Die Gestaltung der Zellkulturphase hat einen entscheidenden Einfluss auf die Stimulus-Sekretions-Kopplung auf der Ebene der Atmungskettenaktivität.