Identifizierung von 14–3-3 Bindungsstellen in Insulinrezeptorsubstrat-2

14–3-3 Proteine binden an phosphorylierte Serin/Threoninreste ihrer Interaktionspartner und steuern darüber intrazelluläre Prozesse. Insulinrezeptorsubstrat (IRS)-2 wurde als 14–3-3 Bindungsprotein identifiziert, die Regulation dieser Interaktion und die Auswirkung auf den Insulin/IGF-1 Signalweg sind unbekannt.

GFP-IRS-2 Konstrukte wurden in HEK293 Zellen transfiziert, mit GFP-Trap® gereinigt und 14–3-3 Bindungsassays durchgeführt. Potentielle Serin/Threoninphosphorylierungsstellen in IRS-2 wurden mit Massenspektrometrie identifiziert und durch Alaninmutanten die Bedeutung dieser Stellen für die IRS-2/14–3-3 Interaktion untersucht. Phospho-spezifische Antikörper wurden generiert und die Regulation der Phosphorylierung in HEK293 und Faozellen studiert. Die Regulation der IRS-2/14–3-3 Bindung wurde zudem in Mauslebergewebe untersucht.

Die Bindung von IRS-2 an 14–3-3 wird durch Insulin/IGF-1 PI3-Kinase abhängig aktiviert, wobei die Region von Aminosäure 300–600 in IRS-2 essentiell ist. In diesem Bereich werden zahlreiche Serin/Threoninphosphorylierungsstellen identifiziert. Die Phosphorylierung von Serin-573 wird durch Insulin/IGF-1 über den PI3-Kinase Weg aktiviert und erscheint notwendig für die IRS-2/14–3-3 Interaktion, da Mutation zu Alanin-573 die Bindung verhindert. Akute Behandlung mit Insulin und Nahrungsaufnahme induziert die Bindung von IRS-2 an 14–3-3 Proteine auch in der Leber von Mäusen.

Die Ergebnisse zeigen die Bedeutung einer neuidentifizierten Serinphosphorylierungstelle in IRS-2 für die Interaktion mit 14–3-3 Proteinen.