Pneumologie 2012; 66 - P179
DOI: 10.1055/s-0032-1302886

COLD-PCR: A powerful tool in routine-diagnostic for cost-neutral detection of minor clones using real-time PCR or pyrosequencing

F Mairinger 1, A Streubel 2, A Roth 2, O Landt 3, W Grüning 2, J Kollmeier 2, T Mairinger 2
  • 1Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Essen
  • 2Helios Klinikum Emil von Behring, Berlin
  • 3TIB MOLBIOL Syntheselabor GmbH, Berlin

Einleitung:

Die COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature) ist eine neue Methode zur Anreicherung unterrepräsentierter Allele in Wildtyp (wt)-Mutanten (mt) Mischungen, unabhängig von der genauen Lokalisation der Mutation innerhalb der Sequenz. Die durch einen initialen Denaturierungsschritt erzeugten Heteroduplexe werden bei dem darauf folgenden Denaturierungsschritt bevorzugt geschmolzen und amplifiziert, was zu einer starken Anreicherung der mt-Allele führt. Dies macht es möglich, auch mit konventionellen Methoden solche Minor-Clones zu detektieren.

Die molekulare Diagnostik sieht sich mit Problemen der Verdünnung potentiell mutierter Zellen durch benignes Gewebe bzw. einer Heterogenität des Tumor konfrontiert, unsere Studie soll hier Abhilfe schaffen. Dafür wurde der Effekt der COLD-PCR auf die Sensitivität sondenbasierter real-time PCR Systeme und der Pyrosequenzierung getestet.

Material und Methoden:

Eine Verdünnungsreihe eines artifiziellen EGFR T790M Konstruktes mit EGFR wt-DNA wurde mit einem LightCycler Assay und der Pyrosequenzierung mit und ohne den Einsatz verschiedener COLD-PCR Protokolle analysiert und die Nachweisgrenzen dieser Methoden bestimmt.

Ergebnisse:

Der LightCycler Assay erzielte die besten Ergebnisse mit einer Kombination aus 10 Zyklen „normaler“ PCR mit anschließenden 45 Zyklen COLD-PCR mit einer COLD-Temperatur von 84°C. Eine Verdünnung mt-DNA/Gesamt-DNA von 0,125% ist damit noch detektierbar (ohne COLD-PCR: 5–10%). Die Pyrosequenzierung erreichte mit dem selben Protokoll ebenfalls eine Nachweisgrenze von 0,125% (ohne COLD-PCR: 2,5–5%).

Diskussion:

Zusammenfassend sieht man das große Potential der COLD-PCR in der modernen Routinediagnostik. Der Nachweis von TKI-resistenten EGFR T790M mutierten Minor-Clones ist somit bereits vor einer Therapie möglich, der Effekt dieser muss jedoch in folgenden, größeren Studien endgültig geklärt werden.