Regulation von RhoA und ROC-Kinase-2 durch CCK in exokrinen Azini der Ratte

Hintergrund/Einleitung: Das Aktinzytoskelett ist für die Regulation der Azinussekretion von großer Bedeutung und spielt möglicherweise für die Pathogenese der Pankreatitis eine Rolle. Ein neuer Signalweg zur Regulation von Aktin konnte mit ROCK identifiziert werden. Hierbei spielt die GTPase RhoA möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung dieses Signalweges.

Zielsetzung: Ziel unserer Studie war es, die Regulation von RhoA und ROCK in Azinuszellen des Pankreas näher zu untersuchen.

Material und Methoden: Die Expression von RhoA und ROCK konnten wir mittels Western Blot zeigen. Mithilfe eines „GST-pull down-Assays“ bestimmten wir die Aktivität von RhoA. Nach Immunopräzipitation wurde die Aktivität von ROCK in einem in vitro Kinase-Assay bestimmt. Myelin basic Protein (MBP), LIMK und Histon H1 dienten hierbei als Substrat. Die Lokalisation von ROCK im Pankreas untersuchten wir mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.

Ergebnisse: Die Stimulation mit CCK induzierte eine rasche und dosisabhängige Aktivierung von RhoA in isolierten exokrinen Azini. Die Western Blot Analyse von RhoA ergab nur nach Stimulation mit 10 nM CCK eine spezifische Bande in einem GST-pull-down-Assay. Co-Immunopräzipitationsexperimente von RhoA und ROCK aus Lysaten von isolierten Azini zeigten eine geringe Assoziation von RhoA mit ROCK in unstimulierten Azini. Dagegen führte die Stimulation mit 10 nM CCK zu einem signifikanten Anstieg. Die ROCK-Aktivität stieg nach supramaximaler (10 nM) CCK-Stimulation rasch an. Die maximale ROCK-Aktivität war ca. 2,3-fach gegenüber unstimulierten Kontrollen erhöht. Stimulation mit 10µM Carbachol, 100 nM Bombesin, 2µM JMV und 10µM TPA induzierte ebenfalls eine Aktivierung von ROCK in isolierten Azini. Die Immunfluoreszenzanalyse ergab in Kryoschnitten von Kontrollpankreata eine Lokalisation im Bereich des apikalen und basolateralen Aktin. Nach Stimulation mit supramaximaler Konzentration von CCK (50µg/kg i.p.) konnten wir eine diffuse intrazelluläre Verteilung, ähnlich den Veränderungen des Aktinzytoskeletts, beobachten.

Schlussfolgerung: Unsere Daten zeigen die Regulation von RhoA und ROCK durch CCK in pankreatischen Azini der Ratte. Dieser Signalweg könnte somit wichtig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und damit für die Pathogenese der akuten Pankreatitis sein.