RSpo2-verstärkte Wnt Aktivität in Krebsstammzellen des Pankreaskarzinoms

M Ilmer; A Boiles; K Yokoi; A Bazhin; J Werner; E Alt; J Vykoukal

doi:10.1055/s-0035-1559518

Zeitschrift für Gastroenterologie, Table of Contents

RSpo2-verstärkte Wnt Aktivität in Krebsstammzellen des Pankreaskarzinoms

M Ilmer ¹, A Boiles ², K Yokoi ³, A Bazhin ¹, J Werner ¹, E Alt ⁴, J Vykoukal ²

¹Ludwig-Maximilians-Universität (LMU), Klinikum der Universität München, Klinik für Allgemeine, Viszeral-, Transplantations-, Gefäß- und Thoraxchirurgie, München, Deutschland
²MD Anderson Cancer Center, Department of Translational Molecular Pathology, Houston, Vereinigte Staaten
³Houston Methodist Research Institute, Department of Nanomedicine, Houston, Vereinigte Staaten
⁴Tulane University Health Science Center, Department of Medicine, New Orleans, Vereinigte Staaten

Abstract

Eine Erklärung für die hohe Mortalität von Patienten mit Pankreaskarzinom (PDAC) sind die sog. Krebsstammzellen (CSC), deren genaue mechanistische Regulation weiterhin unklar ist. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir PDAC-Subpopulationen mit hoher intrinsischer Wnt-Aktivität im Vergleich zu Zellpopulationen mit vernachlässigbarer Wnt-Aktivität.

Wir transfizierten PDAC-Zelllinien mit einem lentiviralen Wnt-Reporterkonstrukt (7xTcf-eGFP/SV40-mCherry (7TGC)). Wnt-aktive Zellen exprimieren daraufhin eGFP, während Wnt-inaktive Zellen kein eGFP exprimieren. Die Basisaktivität in AsPC1, BxPC3, L3.6pl, MiaPaCa2, Panc1, and Patx1 wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. AsPC1, L3.6pl, und Patx1 wurden darüber hinaus in die 5% Wnt+ bzw. 5% Wnt- sortiert und anschließend auf die Expression von CSC-Markern sowie auf EMT-Marker mittels PCR, Western Blot oder Immunofluoreszenz untersucht. Wir untersuchten Spheroid-formation in vitro sowie Tumorigenität im subkutanen Xenotransplantaten. Zusätzlich analysierten wir die Chemoresistenz gegenüber Gemcitabin und TRAIL in den Zellen mittels MTT-Assays und Durchflusszytometrie.

Die Basisaktivität von Wnt in PDAC war, wie erwartet, mit 0,5 – 3% sehr gering. Zellsortierung in Wnt+ und Wnt- zeigte, dass Wnt+ vermehrt CSC Marker (z.B. NANOG) exprimieren und ebenso eine höhere Expression an mesenchymalen Markern (Zeb1 und Snail) aufweisen. Im Gegenteil dazu exprimieren Wnt- bevorzugt epitheliale Marker, wie z.B. E-Cadherin, Cytokeratin 19, und membranständiges β-Catenin. Wir konnten zusätzlich zeigen, dass PDAC Zellen, die besonders empfänglich auf RSpo2, einem Wnt-verstärkendem Liganden, reagierten, eine EMT-Transformation durchmachen, ERK1/2 aktivieren und dadurch den CSC-Pool von PDAC-Zelllinien deutlich erhöhten. Diese Vorgänge konnten durch small molecule inhibitors gegen Wnt (IWP2) bzw. ERK1/2 (UO126) rückgängig gemacht werden. Letztlich waren diese Zellen auch vermehrt tumorigen und mit einem höheren metastatischen Potential ausgestattet.

Wnt+ Pankreaszellen sowie RSpo2-empfängliche Zellen definieren einen CSC-Pool im PDAC mit den entsprechend beschriebenen Signalwegsaktivitäten. So könnte eine Inhibierung dieser Signalwege in Kombination mit etablierter Chemotherapie zusammen das Outcome für das PDAC verbessern.