Visualisierung des γ-H2AX-Epitops durch eine innovative Methode zur DNA-Doppelstrangbruch (DSB)-Analyse in der Radiologie

Zielsetzung:

Strahleninduzierte und sonstige genotoxische Einflüsse können in eukaryotischen Zellen anhand von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) mit der γ-H2AX Immunfluoreszenz-Methode indirekt in Zellkernen nachgewiesen werden. Im Kontext der radiologischen Diagnostik kann das Verfahren zur Abschätzung der induzierten Strahlenschäden dienen. Entscheidender Nachteil dieser Methode ist die Tatsache, dass die Dreidimensionalität des Zellkerns nicht berücksichtigt wird. Im Rahmen des vorgestellten Projektes haben wir daher die etablierte mit der konfokalmikroskopischen Methode verglichen.

Material und Methodik:

MRC-5 Lungenfibroblasten wurden mit einer 44Cs-Quelle bestrahlt. Die Zellen wurden in vitro folgenden Strahlendosen ausgesetzt: 200mGy, 500mGy und 1000mGy. Anschließend wurden die MRC-5 fixiert, mit einem anti-γ-H2AX Antikörper (Maus) inkubiert und mit anti-Maus Alexa 488 gefärbt. Visualisierung und Ermittlung vorhandener Foci erfolgte mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie (Zeiss Axiovert) und Konfokalmikroskopie (Zeiss LSM 880 mit Airyscan).

Ergebnisse:

Bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie wird die Gesamtheit der Fluoreszenzsignale als Integral visualisiert, ohne dass eine einwandfreie Abgrenzung der einzelnen Foci erfolgt. Durch Einsatz der konfokalen Mikroskopie konnten die vorhandenen γ-H2AX-Foci in ihrer tatsächlichen Größe und räumlichen Anordnung innerhalb des Zellkerns einzeln dargestellt werden. Folglich fanden wir zwischen beiden Methoden einen statistisch signifikanten Unterschied identifizierter Foci (p < 0.001).

Schlussfolgerungen:

Konfokales Imaging ermöglicht als semi-quantitative Methode die korrekte Enumerierung vorhandener γ-H2AX-Foci, auch und vor allem bei hoher Focidichte pro Kern. Im Vergleich dazu ermöglicht die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie im Wesentlichen eine Grobabschätzung. Damit ist die konfokale Mikroskopie der etablierten Methode deutlich überlegen.