Molekulare Mechanismen zur Regulation der glattmuskulären, kavernösen Kontraktilität: Grundlage für innovative Therapieansätze der erektilen Dysfunktion[1]

Zusammenfassung

Einleitung: Die Relaxation der glatten, kavernösen Muskulatur ist der entscheidende Schritt für die Initiierung der penilen Erektion, welches das Ziel in der Behandlung der erektilen Dysfunktion (ED) darstellt. Die zelluläre Kontraktilität wird durch Veränderungen der freien zytoplasmatischen Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]_i bestimmt, die durch die Interaktionen des extrazellulären Ca²⁺-Einstroms durch spannungsabhängige L-Typ Ca²⁺-Kanäle (I_Ca), Ca²⁺-Freisetzung aus intrazellulären Speichern und Ca²⁺-Extrusionssysteme moduliert wird. Hormone, Neurotransmitter und andere Mediatoren können die glattmuskuläre Kontraktilität durch Modulation dieser Zellkompartimente via second messenger (intrazelluläre Botenstoffe) beeinflussen.

Material und Methoden: In der vorliegenden Studie wurde die patch-clamp in Kombination mit der Fura-II-Fluoreszenztechnik in enzymatisch isolierten, glatten Muskelzellen des humanen Corpus cavernosum verwendet, um den intrazellulären Wirkungsmechanismus der α₁-Rezeptor-induzierten Muskelkontraktion zu untersuchen.

Ergebnisse: Der selektive α₁-Agonist Noradrenalin (NE) erhöhte die freie, zytoplasmatische Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]_i durch Stimulation der Phospholipase C (PLC) welche Inositol 1,4,5-trisphophat (IP₃) bildet und dadurch Ca²⁺ aus IP₃-sensitiven Ca²⁺-Speichern freigesetzt wird. Die dadurch bedingte Erhöhung der [Ca²⁺]_i scheint für die Stimulation des I_Ca verantwortlich zu sein. Ferner wurde untersucht, welche intrazellulären Signalwege durch Prostaglandin E1 (PGE1), Calcitonin-gene-related peptide (cGRP) und Morpholino-syndnonimin-hydrochlorid (SIN 1), die als potente Agonisten in der SKAT-Therapie verwendet werden, aktiviert werden und ferner wurde deren Effizienz, eine kavernöse, glattmuskuläre Relaxation zu induzieren, auf zellulärer Ebene verglichen. Es zeigte sich, daß alle drei Agonisten durch Hemmung von I_Ca eine Relaxation durch Aktivierung des zyklischen AMP(cAMP)-Metabolismus induzieren. PGE1 (63,4 ± 4,6 %, n = 19) > cGRP (40,0 ± 7,9 %, n = 14) > SIN 1 (30,8 ± 3,9 %, n = 14) senkten dosisabhängig [Ca²⁺]_i durch eine Hemmung von I_Ca. Die Inhibition von I_Ca konnte durch Forskolin (93,4 ± 2,7 %, n = 14), einem direkten Stimulator der Adenylatzyklase, oder durch intrazelluläre Applikation von cAMP (50 µM; 47,9 ± 4,2 %, n = 18) und durch die cAMP-Analoge 8-Br-cAMP (50 µM, n = 11; 59,3 ± 3,7 %, n = 11), 8-CPT-cAMP (50 µM; 64,1 ± 5,4 %, n = 14) imitiert werden. Jedoch konnte intrazellulär appliziertes zyklisches GMP (cGMP; 44,6 ± 5,6 %, n = 21) oder extrazellulär gegebenes SIN 1 I_Ca nicht zusätzlich hemmen, wenn das Zytoplasma bereits mit cAMP angereichert war. Der selektive Blocker der cGMP-inhibierbaren Phosphodiesterase III (PDE III) Milrinon (1 mM; 39,2 ± 7,0, n = 8) inhibierte ebenfalls I_Ca, jedoch war der SIN 1 und Milrinon-Effekt nicht additiv. Darüber hinaus konnte die durch PGE1, cGRP, SIN 1 und cGMP evozierte Ca²⁺-Stromhemmung durch intrazellulär appliziertes RpcAMPS (1 - 5 mM, n = 11), einem spezifischen Blocker der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA), vollständig supprimiert werden.

Schlußfolgerungen: Die experimentellen Befunde unterstreichen die Bedeutung der zytosolischen cAMP-Konzentration für die kavernöse, glattmuskuläre Relaxation und sprechen für eine Stimulation der Adenylatzyklase durch PGE1 und cGRP und eine Guanylatzyklasestimulation durch SIN 1, wobei die Verknüpfung des cAMP- und cGMP-Metabolismus durch die PDE III gegeben ist. Die Inhibition von I_Ca ist durch eine Phosphorylierung des glattmuskulären Ca²⁺-Kanals durch die PKA zu erklären. Die Rolle der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) scheint für die glattmuskuläre, kavernöse Relaxation von untergeordneter Bedeutung zu sein, da der spezifische Agonist der PKG Sp-8-CPT-cGMP (n = 22) keinen Effekt auf die Ca²⁺-Homöostase ausübte. Diese Erkenntnisse sind Voraussetzung für eine zielorientierte Optimierung der konservativen Therapie der ED.

Abstract

Introduction: Relaxation of cavernous smooth muscle cells is essential for the initation of penile erection, which is the therapeutical goal in the treatment of erectile dysfunction (ED). Cellular contractility is mainly regulated by changes in the free intracellular Ca²⁺-concentration [Ca²⁺] that is determined by the interactions of Ca²⁺-influx through voltage-dependent L-type Ca²⁺-channels, Ca²⁺-release from intracellular pools and Ca²⁺-extrusion systems. Hormones, neurotransmitters and other mediators may affect cellular contractility by modulating the activity of these cellular compartments via intracellular second messengers.

Materials and Methods: The present study focuses on the intracellular mechanism of the α₁-adrenoceptor induced cavernous smooth muscle contraction using the patch-clamp technique combined with the fura II fluorescence technique in enzymatically isolated human cavernous smooth muscle myocytes.

Results: The selective α₁-adrenoceptor agonist norepinephrine (NE) increased the free cytoplasmic Ca²⁺-concentration [Ca²⁺] by stimulation of phospholipase C (PLC) resulting in generation of IP₃- which releases Ca²⁺ from IP₃-sensitive Ca²⁺-stores leading to an increase of the transmembraneous Ca²⁺-current (I_Ca). Furthermore, experiments were designed to understand the intracellular pathways activated by prostaglandin E1 (PGE1), morpholino-syndnonimin hydrochloride (SIN 1) and calcitonin gene related peptide (cGRP) used in autoinjection therapy of ED, and to compare their efficiency in inducing cavernous smooth muscle relaxation on the cellular level. PGE1 > cGRP > SIN 1 lowered [Ca²⁺] dose-dependently by inhibition of I_Ca. The inhibition of I_Ca could be imitated by forskolin, a direct activator of adenylate cyclase, and by intracellular application of cAMP (50 µM; 47.9 ± 4.2 %, n = 18), 8-Br-cAMP (50 µM; 59.3 ± 3.7 %, n = 11), 8-CPT-cAMP (50 µM; 64.1 ± 54 %, n = 14). However, intracellular administration of cGMP (50 µM; 44.6 ± 5.6 %, n = 21) or extracellularly applied SIN 1 did not provoke additional inhibition of I_Ca when the cytoplasm was already enriched with cAMP. The selective inhibitor of the cGMP-inhibited phosphodiesterase III (PDE III) milrinon (1 mM, 39.2 ± 7.0, n = 8) also reduced I_Ca, but the SIN 1 and milrinon induced I_Ca inhibitions were not additive. Moreover, the PGE1, cGRP, SIN 1 and cGMP evoked I_Ca inhibitions were completely suppressed by RpcAMPS (100 µM, n = 11), a specific blocker of the cAMP-dependent protein kinase (PKA).

Conclusions: The experimental results underline the importance of cytosolic cAMP concentration for cavernous smooth muscle relaxation. PGE1, cGRP and SIN 1 increase the cytosolic cAMP level, whereby PGE1 and cGRP stimulate adenylatecyclase and SIN 1 activates guanylatecyclase. A connection between the cAMP and cGMP pathways is provided by PDE III. The inhibition of I_Ca can be explained by a phosphorylation of cavernous smooth muscle L-type Ca²⁺-channels. Thus the up- and down-regulation of cavernous smooth muscle Ca²⁺-channels seems to be crucial for the regulation of cavernous smooth muscle tone. This knowledge is useful for the development of molecular strategies in the therapy of ED.

Key words:

Erectile dysfunction - Patch-clamp technique - Fura II - Cavernous smooth muscle - Ca²⁺-channels

1 Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Ziegler anläßlich seines 65. Geburtstages und zu seiner Emeritierung gewidmet. Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Projekt TR 30/27-1).

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1 Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Ziegler anläßlich seines 65. Geburtstages und zu seiner Emeritierung gewidmet. Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Projekt TR 30/27-1).