Hypoosmolarität induziert die Bildung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies in kultivierten Astrozyten durch Stimulation der p47phox NADPH-Oxidase

Einleitung: Die Entwicklung eines glialen Ödems spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der hepatischen Enzephalopathie (HE) [1]. Darüber hinaus ist die Genese reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RNOIs) von Bedeutung [2]. Am Modell hypoosmotisch exponierter Astrozyten wurde kürzlich eine Volumenzunahme als hinreichender Stimulus für die Bildung von RNOIs identifiziert [3]. Hier beschreiben wir die Bedeutung einer astroglial exprimierten NADPH-Oxidase für die schwellungsbedingte RNOI Generierung.

Methoden: Messung reaktiver Sauerstoffspezies durch H₂DCFDA, Western-Blot, Immunopräzipitation, Immunzytochemie, Immunhistochemie.

Ergebnisse: Hypoosmotisch (205mosmol/l) induzierte Astrozytenschwellung induziert einen raschen Anstieg der RNOI-Produktion, der vollständig inhibiert werden kann durch die NADPH-Oxidase Inhibitoren Diphenyliodonium (10µmol/l) und Apocynin (300µmol/l). Inhibition der PKC durch PKC-ζ-Pseudosubstrat (10µmol/l) oder Hemmung der sauren Sphingomyelinase durch AY9944 (5µmol/l) und Desipramin (5µmol/l) inhibierte vollständig die hypoosmotisch induzierte RNOI-Produktion. Western-Blot und PCR belegen die Expression der NADPH-Oxidase Untereinheit p47phox auf Gen und Proteinebene in kultivierten Rattenastrozyten. Immunzytochemische Anfärbungen zeigten ein punktiertes Färbemuster mit zytosolischer Lokalisation der p47phox. Immunpräzipitationsexperimente zeigen eine Zunahme der Serinphosphorylierung der p47phox beginnend 1min nach hypoosmotischer Stimulation mit weiterer Zunahme 5min nach Stimulation. Die Phosphorylierung der p47phox wurde inhibiert in Gegenwart des PKC-Inhibitors Chelerythrine (20µmol/l) und eines PKC-ζ-Pseudosubstratpeptids (10µmol/l). Hemmung der sauren Sphingomyelinase durch AY9944 (5µmol/l) inhibierte ebenfalls die hypoosmotisch induzierte p47phox Serinphosphorylierung. Immunzytochemische Analysen von Rattenhirnen zeigen im cerebralen Cortex eine Assoziation des astrozytären Markerproteins GFAP und der p47phox was auf die in vivo Relevanz der Befunde hinweist.

Diskussion: Hypoosmotisch stimulierte Astrozyten sind ein etabliertes Modell um Effekte einer astrozytären Volumenzunahme auf Signaltransduktion und Funktion zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt eine hypoosmotisch induzierte, PKC- und Ceramid vermittelte Aktivierung der p47phox. Eine NADPH-Oxidase-vermittelte Produktion von oxidativem Stress durch Astrozyten mag zur kovalenten Modifikation von Proteinen unter HE-relevanten Bedingungen beitragen.

Literatur: [1] Häussinger D, Kircheis G, Fischer R, Schliess F, vom Dahl S. (2000) J Hepatol, Jun;32(6):1035-8. [2] Häussinger D & Schliess F (2005) Neurochem Int., Jul 47(1-2):64-70 [3] Schliess F, Foster N, Görg B, Reinehr R, Häussinger D. (2004) GLIA, Jul 47(1):21-9

Key words

Hepatische Enzephalopathie - Hypoosmolarität - Reaktive Sauerstoff- und Sitckstoffspezies