Identifizierung und funktionale Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, die im 5’-Enhancer des Glutamin-Synthetase-Gens wechselwirken

In der Leber von Säugern wird die Expression des Enzyms Glutamin-Synthetase (GS) in weniger als 8% der Hepatozyten beobachtet. Diese sind um die hepatischen Venolen lokalisiert und zeigen eine ausgesprochen hohe Expression. So kann der Anteil an GS-Protein durchaus 1% der gesamten Proteinmenge der Zellen betragen. Der für die hohe transkriptionelle Aktivität des korrespondierenden Gens maßgeblich verantwortliche Enhancer ist 2500 Basenpaare oberhalb des Transkriptionsstartpunktes lokalisiert. Trotz intensiver Studien der letzten Jahre, die zu einer Eingrenzung und näheren Charakterisierung des Enhancers beigetragen haben, waren die mit ihm wechselwirkenden Transkriptionsfaktoren bislang unbekannt. Daher wurden in der vorliegenden Studie Kernproteine gereinigt und verschiedene Strategien eingesetzt, um die wechselwirkenden Proteine zu identifizieren. Die durchgeführten konventionellen chromatographischen Verfahren in Kombination mit Gel-Retardierungs-Assays führten zur Reinigung von vier Proteinen. DNAse I footprinting-Experimente mit den gereinigten Proteinen zeigten, dass mindestens zwei geschützte Abschnitte innerhalb des Enhancers liegen, bei denen es sich zum einen um eine potentielle Bindungsstelle für den Faktor STAT5 und zum anderen um eine Bindungsstelle für ein Protein aus der Familie der TCF/LEF-Faktoren handeln könnte. Gel-Retardierungs-Experimente unter Verwendung eines STAT5-spezifischen Antikörpers bestätigten ebenso wie Western-Blots die Aufreinigung und Bindung von STAT5. Obwohl bislang noch ungeklärt ist, welches Mitglied der TCF/LEF-Familie in der Nachbarschaft zu STAT5 bindet, zeigen erste Reportergen-Assays, dass beide Faktoren bei der Kontrolle der Expression der GS in komplexer Weise miteinander wechselwirken. Dies ist insofern von besonderem Interesse, da gezeigt werden konnte, dass die Expression der GS durch Faktoren des β-Catenin-Signaltransduktionsweges kontrolliert werden kann und β-Catenin seinen Einfluss auf die Expression in Verbindung mit Faktoren der TCF/LEF-Familie ausübt.

Literatur: Kruithof-de Julio, M., Labruyere, W.T., Ruijter, J.M., Vermeulen, J.L., Stanulovic, V., Stallen, J.M., Baldysiak-Figiel, A., Gebhardt, R., Lamers, W.H., Hakvoort, T.B. (2005) The RL-ET-14 cell line mediates expression of glutamine synthetase through the upstream enhancer/promoter region. J. Hepatol. 43, 126-131 Loeppen, S., Schneider, D., Gaunitz, F., Gebhardt, R., Kurek, R., Buchmann, A., Schwarz, M. (2002) Overexpression of glutamine synthetase is associated with beta-catenin-mutations in mouse liver tumors during promotion of hepatocarcinogenesis by phenobarbital. Cancer Res. 62, 5685-5688. Gaunitz, F., Weber, S., Scheja, L., Gebhardt, R. (2001) Identification of a cis-acting element and a novel trans-acting factor of the glutamine synthetase gene in liver cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 284, 377-383.

Key words

Glutamin Synthetase - LEF/TCF - STAT5