Regulation des Promotors der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase in adenoviral transduzierten kultivierten primären Rattenhepatozyten

Ausgangssituation: Die Transplantation von Hepatozyten zur Therapie bei Lebererkrankungen gilt zunehmend als Alternative zur Organtransplantation. Im Vordergrund steht dabei die Funktionalität der transplantierten Hepatozyten im Empfängerorgan, wobei insbesondere die physiologische Regulation der Promotoren leberspezifischer Gene für die Zelltherapie von monogenetischen Stoffwechselerkrankungen der Leber von Bedeutung ist.

Ziele: Das Ziel war die Herstellung transgener primärer Rattenhepatozyten, in denen die Regulation des Promotors der cytosolischen Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PCK1) durch Glucagon (cAMP) und Insulin untersucht werden sollte. Herkömmliche, nichtvirale Transfektionsmethoden sind nicht effizient genug, um primäre Hepatozyten mit einer für Transplantationszwecke ausreichend hohen Transfektionseffizienz zu erhalten. Aus diesem Grund wurden adenovirale Vektoren hergestellt, die eine hohe Infektionsrate gewährleisten und damit weiterführende Untersuchungen nach Transplantation in eine Rattenleber ermöglichen.

Methoden: Es wurde ein adenoviraler Vektor (Adenovirus Typ 5, Qbiogene) konstruiert, der die Luciferase als Reportergen unter der Kontrolle des leberspezifischen Promotors der PCK1 exprimierte. Hepatozyten wurden aus Lebern von 7–11 Wochen alten Fischer-Ratten durch Collagenase-Perfusion isoliert und serumfrei unter Zusatz von EGF und HGF für 24h kultiviert. Zur Untersuchung der transkriptionellen Aktivität wurden die Hepatozyten nach 24h mit rekombinantem Adenovirus transduziert und nach weiteren 48h mit Glucagon (cAMP)±Insulin stimuliert. Nach weiteren 8h wurden die Zellen lysiert und die Luciferase-Aktivität bestimmt.

Ergebnisse: Glucagon oder cAMP stimulierten in viral transduzierten Rattenhepatozyten die Luciferaseaktivität konzentrationsabhängig. Insulin als Antagonist der Glucagonwirkung hemmte den durch Glucagon oder cAMP stimulierten Anstieg der Luciferaseaktivität. Steigende Mengen an Viruspartikeln führten proportional zu steigender Luciferaseaktivität. Unabhängig von der Menge an Viruspartikeln während der Transduktion stimulierte 10µM cAMP die Aktivität immer ca. 50-fach.

Schlussfolgerung: In adenoviral transduzierten Hepatozyten konnte erstmals gezeigt werden, dass der leberspezifische Promotor der PCK1 physiologisch durch Glucagon und Insulin reguliert wird. Der adenovirale Gentransfer stellt somit ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Regulation der Genexpression in transplantierten Hepatozyten dar.

Key words

Adenovirus - Rattenhepatozyten