Antimykotische Therapie – Erfolgreicher zum Ziel durch beschleunigte Diagnostik

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Bild: Thieme Verlagsgruppe, Thomas Stephan

Bei Intensivpatienten können opportunistische Erreger mit geringer Virulenz zu schweren Infektionen wie Mykosen durch Candida albicans oder Aspergillus führen. Gezielte Diagnostik und eine enge Zusammenarbeit zwischen Intensivmedizin und medizinischer Mikrobiologie sind der Leitgedanke des jährlich stattfindenden Workshops des Consilium Mycologicum, der sich Mitte April 2010 unter anderem mit modernen Untersuchungsverfahren beschäftigte. Deutlich wurde dabei insbesondere, dass die zeitgemäße, frühzeitige und gezielte Diagnostik eine ebenso frühzeitige Therapie ermöglicht, die die Überlebenschancen von Patienten mit schweren Mykosen erheblich verbessert.

Klassische Identifizierung von Hefen ist kosten- und arbeitsintensiv

Als ein Beispiel nannte Prof. Gerhard Haase, Aachen, die Speziesidentifizierung von Hefen mittels MALDI-TOF-Fingerprint-Analyse. Die Identifizierung von Hefen ist zahlenmäßig die häufigste Aufgabe im mykologischen Labor. Während eine klassische phänotypische Identifizierung mittels Kohlenhydratassimilation und mikromorphologischer Merkmale in der Regel mindestens 48 Stunden dauert, ist eine vergleichsweise schnelle molekulargenetische Identifizierung mittels Sequenzvergleich weiterhin relativ teuer und arbeitsintensiv. Nach der Erstbeschreibung der Identifizierung von Bakterien durch Massenspektrum-Fingerprinting Analyse im Jahr 1996 hat es mehr als 10 Jahre gedauert, bis durch die Weiterentwicklung dieser Technik verlässliche und routinetaugliche Massenspektrometer für diese Aufgabe zur Verfügung standen. Nachdem zunächst der Schwerpunkt dieser Analysen im Bereich der Bakteriologie lag, gibt es seit ca. 2 Jahren auch mehrere Publikationen, die eine Erfolg versprechende Anwendung dieser Technik für die Identifizierung von Hefen beschreibt. So gibt es zum Beispiel schon umfangreiche Datenbanken für Hefen (> 200 Arten) bei den beiden kommerziellen Anbietern dieser Technik (Bruker & AnagnosTec).

Massenspektrum-Analyse bei bakteriellen Erregern bereits etabliert

Zu den Erfahrungen mit der Identifizierung humanpathogener Sprosspilze mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie äußerte sich Prof. Günter Marklein, Bonn.

Die Matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie nimmt inzwischen in vielen klinisch-diagnostischen Laboratorien einen festen Platz in der Diagnostik bakterieller Infektionserreger ein. Die Zahl der Publikationen zur Eignung der Methodik im Rahmen der mykologischen Labordiagnostik ist jedoch noch relativ gering.

MALDI-TOF-MS-Technik auch bei klinischen Hefe-Isolaten erprobt

Die traditionelle klinisch-mykologische Diagnostik basiert auf einer ganzen Reihe phänotypischer Merkmale und biochemischer Tests zur Spezies-Identifizierung der Isolate, die nicht selten 24-72 Stunden bis zum endgültigen Resultat in Anspruch nimmt.

Molekulare Verfahren wie PCR oder rRNA-Sequenzierung verkürzen zwar das diagnostische Intervall, sind aber relativ kostspielig.

"Wir überprüften daher die Eignung der MALDI-TOF-MS-Technik für die schnelle und exakte Identifizierung klinischer Hefe-Isolate unter Verwendung des Systems Microflex LT zusammen mit der MALDI Biotyper Software (Bruker Daltonik GmbH, Bremen). Im ersten Teil der Untersuchung prüften wir annähernd 300 Kulturen (Referenzstämme und rezente Isolate konventionell identifizierter Sammlungsstämme), im zweiten Teil ca. 200 frische Isolate aus den laufenden Routine-Einsendungen."

Ausgehend von Einzelkolonien auf Sabouraud-Agar erfolgte nach 2 kurzen Extraktions- und Zentrifugationsschritten die Analyse der Probe, die mit einer Matrix auf eine MALDI-Target-Platte aufgetragen worden war (Gesamt-Zeitaufwand ca. 10 min).

Im ersten Untersuchungsabschnitt ergaben sich für 93 % der Stämme "auf Anhieb" übereinstimmende Resultate, für die übrigen Isolate erst nach Aufnahme entsprechender Referenzstämme in die Datenbasis, die teils erst nach 26S rRNA-Gen-Sequenzierung ermittelt wurden (z. B. C. dubliniensis, C. metapsilosis, C. orthopsilosis, C. nivariensis, P. fabiani).

Unter Routinebedingungen (2. Teil der Untersuchungen) wurden 98 % der Ergebnisse korrekt und zuverlässig ermittelt.

Zuverlässige und kostengünstige Methode ermöglicht schnelle Diagnose

"Zur Identifizierung klinischer Sprosspilze erwies sich MALDI-TOF MS als zuverlässige und kostengünstige Methode, die aufgrund des geringen Arbeits- und Zeitaufwandes sowie durch sichere Interpretation der Befunde eine schnelle Diagnose ermöglicht" resümierte Marklein.