Prätherapeutische Biomarker des Lungenkarzinoms unter besonderer Berücksichtigung der Bronchoskopie

Zusammenfassung

Molekulare Biomarker bekommen eine zunehmende Bedeutung in der Behandlung von Patienten mit einem Lungenkarzinom. Sie unterstützen die Diagnosestellung, die Wahl der Therapie und helfen bei der Einschätzung der Prognose. Aktuell ist die bronchoskopische Probenentnahme mit der Bestimmung Gewebe-basierter Marker das Verfahren der Wahl. Möglicherweise wird sich dies zukünftig ändern, wenn nichtinvasive Methoden zur Markerbestimmung aus Blut oder Ausatemluft etabliert werden können. Bis dahin ist insbesondere von Bedeutung, mit welcher Methodik die Proben entnommen werden und wie sie prozessiert werden auf dem Weg in das pathologische Labor.

Abstract

Molecular biomarkers are becoming increasingly significant in the workup of lung carcinoma patients. They assist in diagnosis, selecting the most adequate therapy and determining prognosis. Obtaining blood based biomarkers or volatile markers in exhaled breath may provide a less invasive method in the future. For the time being, bronchoscopy is still the method of choice to obtain specimen and assess tissue based biomarkers. The techniques how specimen are collected and processed for analysis are of paramount importance.

Hintergrund

„Herr X, Sie haben einen Schatten auf der Lunge!“ Kaum ein Satz eines Arztes erzeugt bei einem Patienten so viel Angst wie diese Aussage. Zugleich weckt er den Wunsch nach einem einfachen Testverfahren, welches die Unsicherheit rasch beendet, die als besonders quälend empfunden wird, und welches hilft, die bestmögliche Therapie auszuwählen. Doch wie weit sind wir entfernt von der raschen, nicht- bis wenig invasiven Diagnostik beim Lungenkrebs? Utopie oder doch greifbare Realität?

Das Lungenkarzinom ist trotz aller Fortschritte in Diagnostik und Therapie die häufigste zum Tode führende maligne Erkrankung mit nahezu unverändert schlechter Prognose. Neben Maßnahmen der Prävention (Rückgang des Rauchverhaltens und verbesserter Nichtraucherschutz) ist eine Änderung dieser Tatsache nur durch Sicherung der Tumore in früheren Stadien als bisher zu erwarten, da die Mehrzahl der Patienten bei Diagnosesicherung bereits in einer palliativen Situation ist. Unlängst konnte im Rahmen großer Screening-Studien („National Lung Screening Trial (NLST)“, „NELSON-Trial“) gezeigt werden, dass eine relative Senkung der Mortalität um bis zu 20 % mittels Low-Dose-CT-Screening potenziell erzielt werden kann, indes mit dem Nachteil einer immens hohen Zahl an falsch positiven Befunden (96,4 % im NLST) [1] [2]. Diese führen zu einer erheblichen psychischen Belastung der Patienten, zu unnötigen weiteren diagnostischen Verfahren mit erhöhter Morbidität und Mortalität und hohen potenziell vermeidbaren Kosten für das Gesundheitssystem. Zudem ist bei jedem fünften Patienten der durch ein CT-Screening entdeckte Tumor nicht die zum Tode führende Erkrankung („Overdiagnosing“) [3].

Zur Verbesserung der Frühdiagnostik bedarf es daher optimierter Strategien, die die „Vortestwahrscheinlichkeit“ für die diagnosesichernde invasive Diagnostik erhöhen. Nicht invasiv gewonnene molekulargenetische Biomarker (diagnostische Biomarker) können die Spezifität und den positiven Vorhersagewert (PPV) erhöhen und werden hierfür aktuell getestet [4].

Ein weiteres Anwendungsgebiet molekulargenetischer Biomarker ergibt sich aus der Frage, welche Therapie für den betroffenen Patienten angewendet werden sollte. Tests auf Mutationen des EGFR-Gens oder von EML4-ALK-Translokationen sind bereits klinisch etabliert – weitere sind zu erwarten. Diese prädiktiven Biomarker ermöglichen es, den Patienten der individuell bestmöglichen Systemtherapie zuzuführen und sind somit grundlegend im Konzept der personalisierten Krebsmedizin. Die hierfür zur Verfügung stehenden Gewebeproben werden im Zeitalter des EBUS allerdings immer kleiner und die molekularen Untersuchungsmethoden an diesen Proben vielfältiger, sodass ein „ökonomischer“ und abgestimmter Umgang mit dem Probenmaterial an Bedeutung gewinnt. Es besteht die Hoffnung, dass die Gewebe-basierte molekulargenetische Charakterisierung des Tumors auch zur Entwicklung von Biomarkern führt, die sich dann auch in Atemluft, im Blut oder im Urin bestimmen lassen können.

Grundsätzliche Herausforderungen der klinischen Anwendung

Onkologische Biomarker können grundsätzlich Informationen liefern, ob ein Tumor vorliegt (diagnostische Marker), auf welche Therapie er anspricht (prädiktive Marker) und wie die Prognose des Patienten einzuschätzen ist (prognostische Marker) [5]. Diagnostische Marker trennen in der Idealvorstellung eindeutig Gesunde von betroffenen Personen, wobei Überschneidungen im Grenzbereich ([Abb. 1]) nahezu immer vorliegen. Von besonderer Bedeutung ist daher die Festlegung des Grenzwertes. Liegt dieser mehr im gesunden Kollektiv so wird die Sensitivität erhöht zu Ungunsten der Spezifität. Umgekehrt sinkt die Sensitivität bei steigender Spezifität, wenn man den Grenzwert in das erkrankte Kollektiv legt.

Abb. 1 Bei jedem Biomarker kann durch Verschiebung des Grenzwertes die Sensitivität auf Kosten der Spezifität erhöht werden und umgekehrt. Die grüne Gruppe sind die Gesunden, die rote die Erkrankten.

Besondere Bedeutung haben in den letzten Jahren die sog. „-omics“- Techniken gewonnen, benannt nach der gemeinsamen Endung von Genomics, Proteomics, Metabolomics, etc. Diese Disziplinen beschreiben die Testung und bildliche Darstellung der Gesamtheit der Gene (Genom), Proteine (Proteom) oder Metabolite (Metabolom) in einem abgegrenzten Kompartiment (Zelle, Gewebe) zu einem definierten Zeitpunkt. Die Auswertung erfolgt häufig durch Mustererkennung und bedarf erheblicher biostatistischer Expertise. Bei extrem großen Datenmengen und sehr vielen Variablen steigt die Möglichkeit, vermeintliche Zusammenhänge irrtümlich zu identifizieren. Diese Pseudo-Zusammenhänge, auch „Voodoo-Korrelationen“ genannt, müssen bei kritischer Analyse enttarnt werden [6]. Ein Bezug der gefundenen Muster zu biochemischen Prozessen ist mit diesen Methoden zudem nur schwer möglich.

Ein grundsätzliches Problem der Biomarkerforschung ist die fehlende Darstellung prätherapeutischer Biomarker im DRG-System. Obwohl das „D“ in DRG für Diagnostik steht, ergeben sich Erlöse ganz besonders durch Therapien bzw. Prozeduren und nicht durch Verbesserung diagnostischer Verfahren. Dies erschwert die klinische Einführung selbst effizienter Biomarker ganz erheblich.

Obwohl bereits seit Jahren eine nicht unerhebliche Zahl an molekulargenetischen Lungenkrebs-Markern zur Optimierung der Diagnostik entwickelt und getestet wurde, hat es bis dato keiner der diagnostischen Biomarker geschafft, in den klinischen Alltag einzuziehen. Die oben genannten Probleme sind hierfür ursächlich.

Gewebe-basierte Biomarker

Die endobronchiale Biopsie (EBB) sowie die transbronchiale Biopsie (TBB) werden standardmäßig zur Lungenkarzinom-Diagnostik eingesetzt und weisen typischerweise einen Durchmesser von 1 – 3 mm auf. Bis vor nicht allzu langer Zeit war diese Diagnostik mit der Aussage „Nicht-kleinzelliges Karzinom“ versus „Kleinzelliges Karzinom“ erledigt. Es ist wichtig zu wissen, dass eine reine Malignitätsdiagnose auf einem einzelnen Hämatoxylin-Eosin (HE) Schnitt mit nur wenigen Tumorzellen (50 bis 100) möglich ist, falls diese eindeutig invasiv wachsen, z. B. unterhalb der respiratorischen Bronchialschleimhaut oder in Form einer Lymphangiosis carcinomatosa ([Abb. 2]). Mit dem Aufkommen der prädiktiven genomischen Alterationen haben sich die Anforderungen geändert und der Verteilungskampf um das Biopsat begonnen. Es muss nun häufig neben der HE und den Schleim- und Bindegewebsfärbungen Alcianblue-Periodic Acid Schiff (AB-PAS) und Elastica van Gieson (EvG) Immunhistochemie (IHC) durchgeführt werden, typischerweise ein 2er- oder 4er-Panel (TTF1, p63 /40, CK7, CK5 /6) zur Differenzialdiagnose Adenokarzinom versus Plattenepithelkarzinom. Weitere Leerschnitte werden zur Bestimmung einer evtl. EML4-ALK-Translokation (Vorselektion mittels IHC, Bestätigung mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) sowie weiteren IHC- oder FISH-Untersuchungen für ROS1, RET, c-MET (Adenokarzinom) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (FGFR1, Plattenepithelkarzinom) verwendet. Schlussendlich sollten noch genügend Tumorzellen übrig sein für die DNA-Extraktion mit anschließender PCR-Sequenzierung für z. B. EGFR-, BRAF- oder HER2-Mutationen ([Abb. 3]). Leider sind die HE, AB-PAS und EvG gefärbten Schnitte für die DNA-Extraktion nur beschränkt brauchbar, da die verwendeten Säuren die DNA degradieren.

Abb. 2 Transbronchiale Biopsie von 2 x 2 mm Ausdehnung mit drei atypischen Drüsenstrukturen, ca. 50 Zellen innerhalb von Lymphgefäßen und damit Nachweis einer Lymphangiosis carcinomatosa. Befund diagnostisch für wenig differenziertes Adenokarzinom, aber Gewebe nicht ausreichend für weitere Molekularpathologie (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, 25-fach bzw. 200-fach)

Abb. 3 Aufarbeitung einer Lungenbiopsie. Insgesamt 21 Schnitte aus den ersten drei Stufen mit vier Leerschnitten (LS) für Immunhistochemie (TTF1, p63, CK7, und CK5 /6). HE = Hämatoxylin-Eosin, Schleimfärbung Alcianblue-Periodic Acid Schiff (AB-PAS), Bindegewebsfärbung Elastica van Gieson (EvG)

Frisch entnommene Gewebeproben werden üblicherweise in Formalin fixiert und dann in Paraffin eingebettet (FFPE). Dieses Verfahren ist etabliert, standardisiert und relativ kostengünstig. Nachteilig ist allerdings, dass hierdurch molekulargenetische Untersuchungen negativ beeinflusst werden können und insbesondere die RNA-Qualität leidet. Daher wird zunehmend Gewebe – insbesondere für wissenschaftliche Zwecke – möglichst kurzfristig nach der Entnahme in Flüssigstickstoff kryokonserviert und qualitätsgesichert in Biobanken gelagert. Dieses Verfahren lässt zwar auch im weiteren Verlauf alle molekulargenetischen Untersuchungen zu, ist aber deutlich kosten- und personalintensiver. Zudem besteht insbesondere bei kleineren Biopsien Unsicherheit hinsichtlich des verbliebenen Tumoranteils in der Gewebeprobe, nachdem ein Anteil zur Diagnosestellung verwendet wurde.

Moderne bronchoskopische Biopsieverfahren

EBUS-TBNA

Auf Grund einer inzwischen nahezu flächendeckenden Verfügbarkeit der Methode und der breiten Evidenz in Bezug auf die diagnostische Sicherheit, ist die EBUS-TBNA inzwischen das primäre Verfahren zur mediastinalen Lymphknotenstadiierung [7]. Die diagnostische Sicherheit steigt bis zur dritten Probenentnahme an, wobei bei sichtbarem Stanzzylinder („Würmchen“) im Biopsat, zwei EBUS-TBNA ausreichend sind [8]. In der Forschung ist dieses derart gewonnene Gewebsmaterial allerdings deutlich unterrepräsentiert. Die weitaus meisten wissenschaftlichen Untersuchungen erfolgen an operativ entnommenem Tumorgewebe. Es konnte aber bereits gezeigt werden, dass alle aktuell klinisch bedeutsamen prädiktiven Marker und auch umfassende genomische Untersuchungen an EBUS-TBNA-Proben sicher durchzuführen sind, obschon das Tumormaterial, welches durch die EBUS-TBNA gewonnen werden kann, sehr klein ist [9] [10] [11]. Bei ausgedehnter molekularer Diagnostik oder zu Forschungszwecken sind allerdings mindestens vier EBUS-TBNA pro Lymphknotenstation angeraten. Die Zahl der prädiktiven Marker steigt weiter an und noch ist unklar, ob auch zukünftig alle notwendigen molekulargenetischen Untersuchungen an wenig Tumormaterial bestimmt werden können, insbesondere da bei zunehmendem Wissen über Resistenzmechanismen Re-Biopsien nach Chemo- oder Strahlentherapie notwendig werden [12]. Ob diese Proben für unterschiedliche Analysen ohne Qualitätsverlust aufgeteilt werden können, ist noch nicht geklärt. Zudem ist unklar, wie hoch der Tumorzellgehalt der Probe ist. Ein zu geringer Anteil an Tumorzellen kann das molekulare Testergebnis negativ beeinflussen. Es ist daher zwingend notwendig, den Prozess der Probenentnahme, -behandlung und -analyse zu standardisieren.

Kryobiopsie

Die Kryobiopsie ist eine vielversprechende neue Technologie in der Bronchoskopie ([Abb. 4]). Die Sonde ermöglicht die Entnahme einer wesentlich größeren Biopsie. Die mittlere Biopsieoberfläche liegt bei 10,4 mm² gegenüber 5,2 mm² im Vergleich zu Zangenbiopsien, die Artefakt-freie Oberfläche 9,6 mm² vs. 3,6 mm². TBBs können bis zu > 15 mm² Oberfläche haben. Das Gefrieren geschieht über den Joule-Thomson Effekt auf bis – 90° C mittels N₂O/CO₂ Gas, was zu geringen Gewebe-Artefakten führen soll. Blutungskomplikationen sind in Studien nicht signifikant häufiger [13]. Die Kryobiopsie wird anschließend ebenfalls mittels Formalin-Fixation und Paraffin-Einbettung verarbeitet, oder ein Teil wird direkt in eine Gefrier-Tumorbank gegeben. Bis zu 50 000 Tumorzellen können so gewonnen werden, was grundsätzlich eine weitergehende molekularpathologische Analytik wie NGS („next generation sequencing“) erlaubt.

Abb. 4 Die Kryosonde (oben) erlaubt die Gewinnung größerer Tumorproben, sodass eine umfassende immunhistochemische und molekulargenetische Diagnostik ermöglicht wird. Auch Material, welches mittels EBUS-TBNA (unten) gewonnen wird, ist für viele Untersuchungen ausreichend.

Navigationsbronchoskopie/Radialer Ultraschall

Zur Verbesserung der Rundherddiagnostik werden die elektromagnetische Navigation (EMN) und die radiale Ultraschallsonde („Minisonde“) eingesetzt. Mit diesen beiden Methoden ist es, im Vergleich zur konventionellen transbronchialen Biopsie, mit einer höheren Wahrscheinlichkeit möglich, den zuführenden Bronchus zu identifizieren, der zur Probenentnahme aus dem Tumor notwendig ist. Bei der EMN wird das Bronchoskop im elektromagnetischen Feld mit Hilfe einer virtuellen Bronchoskopie gesteuert, die an Hand eines CT-Datensatzes erstellt wird. Hierdurch können zwei von drei Rundherden definitiv diagnostiziert werden [14].

Die radiale Ultraschallsonde kann durch den Arbeitskanal eines Bronchoskopes bis in die Lungenperipherie vorgeschoben werden und ermöglicht die endosonografische Visualisierung von Rundherden. Hiermit können etwa 73 % der peripheren Lungenkarzinome und 46 % aller Herde < 2 cm diagnostiziert werden [15] [16].

Epigenetische Marker

Tabakrauch enthält zahlreiche Karzinogene, welche einen synergistischen Tumor-induzierenden Effekt auf alle betroffenen Schleimhäute haben, was als Feldkanzerisation bezeichnet wird. Nach der Theorie der Feldkanzerisierung entstehen parallel an zahlreichen Schleimhaut-„Hotspots“ (multifokales „Feld“) genetische und epigenetische Veränderungen, die über die Vorstufe der Dysplasie zum invasiven Lungenkarzinom führen können [17]. Das Konzept der Feldkanzerisierung eröffnet die Perspektive einer Vorsorge-Untersuchung im Sinne einer Suche nach „onkogenen Vorgängen“ in einer umgebenden Tumorvorstufe.

Eine der bekannten epigenetischen Alterationen ist die vermehrte DNA-Methylierung, z. B. an sogenannten CpG-Inseln im Bereich der Gen-Promotoren. Verschiedene Genprodukte wie RASSF und p16 sind beim Lungenkrebs betroffen. Diese Hypermethylierung innerhalb Tumor-spezifischer DNA kann mit einer methylierungsspezifischen PCR detektiert werden. Diese Methode hat potenziell eine hohe diagnostische Wertigkeit, da solche PCR-Reaktionen auch in zytologischen Flüssigkeiten wie Bronchiallavage, Bronchialsekret, Sputum oder Pleuraergüssen durchgeführt werden können sowie im peripheren Blut. Da durch die Tumornekrose DNA freigesetzt wird, sind auch zellfreie Flüssigkeiten geeignet, und für eine erfolgreiche PCR genügen Volumina von nur 100 Mikroliter durchaus.

Basierend auf einem Tissue Microarray (TMA) von NSCLC Operationspräparaten konnten wir zeigen, dass die DNA-Methylierung der Homeobox Gene PITX2 und SHOX2 ein unabhängiger prognostischer Biomarker ist für die Krankheitsprogression des Nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms [18]. Durch die Kombination von histopathologischer Beurteilung der EBUS-TBNA und SHOX2-Methylierung kann eine bessere Aussage über den lokalen Lymphknoten-Status erzielt werden. Es wurden einerseits zusätzliche Tumorherde identifiziert und andererseits gutartige Lymphknoten-Vergrößerungen bestätigt. Dies reduzierte weitergehende diagnostische Untersuchungen [19].

mRNA und microRNA

Als wichtige neue Genregulatoren sind in den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) identifiziert worden. Sie kontrollieren die Genexpression von weit mehr als der Hälfte des menschlichen Genoms. miRNAs sind zelluläre RNA-Fragmente mit einer Länge von wenigen Nukleotiden, die keine Protein-kodierende Funktion, dafür aber eine Kontrollfunktion besitzen: Die einzelsträngigen miRNAs binden an die komplementäre mRNA eines Zielgenes und bewirken dadurch eine Destabilisierung der mRNA oder eine Blockade der Translation der mRNA zu einem Protein. miRNAs wirken somit mehrheitlich als „genesilencers“ – über die Hemmung von endogenen Inhibitoren durch miRNAs kann allerdings ein bestimmter Signalweg im Sinne des mathematischen „minus x minus = plus“ auch verstärkt aktiviert werden. Bisher sind mehr als 2500 miRNAs beschrieben worden, wobei eine bestimmte miRNA mehrere Gene regulieren und umgekehrt die Expression eines Gens durch verschiedene miRNAs verändert werden kann.

Bei Lungentumoren spielen miRNAs bei drei verschiedenen Prozessen eine zunehmend wichtige Rolle: 1. bei der Pathogenese, 2. im Rahmen der Diagnostik bzw. der Festlegung des therapeutischen Prozedere und 3. als prognostische Marker [20]. Exemplarisch wird in der Folge jeweils eine arbiträr ausgewählte miRNA erwähnt. In der Karzinogenese von Lungentumoren sind miRNAs als pathogenetische Faktoren für die Dysregulation von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen verantwortlich. Die miR-150 hemmt zum Beispiel die Expression des pro-apoptotischen Faktors p53, sodass Lungenkarzinomzellen vermehrt wachsen [21]. Verschiedene Studien haben den diagnostischen Wert der miR-205 hervorgehoben, welche die histologischen Subtypen von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen identifizieren soll. Eine Überexpression von miR-205 spricht dabei für das Vorliegen eines Plattenepithelkarzinoms [22]. Die miR-30 und die miR-221/222 sind mit der Aktivität des EGFR-Signalweges assoziiert worden und könnten somit das individuelle Ansprechen auf eine Tyrosinkinase-Therapie antizipieren [23]. Bezüglich Prognose schließlich könnte aufgrund der miR-375 eine Aussage gemacht werden: Patienten, welche die miR-375 im Gewebe oder Blut vermindert exprimieren, zeigen ein deutlich schlechteres Überleben im Vergleich zu Patienten mit vermehrtem Nachweis dieser miRNA [24]. Boeri et al. zeigten zudem kürzlich anhand von zwei randomisierten CT-Screening-Studien, dass Panels von 13 miRNAs in der Lage sind, die Tumorentwicklung vorherzusagen und eine Prognose zu ermöglichen [25]. Es konnte zudem grundsätzlich gezeigt werden, dass die Bestimmung von miRNAs an Hand von EBUS-TBNA Proben möglich ist [26].

Das „miRNA-Profiling“ steckt sicherlich noch in seinen Anfängen. Die Bestimmung einer individuellen miRNA-Signatur wird aber in Zukunft dazu beitragen, die Entstehung von Lungentumoren besser zu verstehen, das biologische Verhalten eines Tumors abzuschätzen und eine individualisierte Therapie anbieten zu können.

Biomarker im Serum („liquid based-biopsy“)

Zurzeit existiert kein Blutbiomarker, welcher mit ausreichender Spezifität und Sensitivität auf ein Lungenkarzinom hinweist, da die meisten dieser Marker auch bei anderen Krebsarten oder niedertitrig bei gutartigen Erkrankungen (z. B. COPD) gemessen werden können [27]. Die bis dahin in Bezug auf nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (NSCLC) am besten untersuchten Biomarker sind CYFRA 21–1, CEA und CA-125, welche allesamt den Proteinbiomarkern zuzuordnen sind. In fortgeschrittenen Stadien des NSCLC konnte immerhin in mehreren Studien gezeigt werden, dass erhöhte Werte von CYFRA 21–1 und CEA sowie auch von deren Kombination in Form des Tumormarker-Index (TMI) mit einer erhöhten Mortalität assoziiert sind [28]. Zudem gibt es Hinweise, dass einige Biomarker (CYFRA 21–1, NSE) mögliche Prädiktoren für das Ansprechen einer Chemotherapie bei NSCLC und SCLC sind [29]. Allerdings ist die Evidenzlage zum Einsatz dieser Biomarker bei operablen NSCLC-Stadien widersprüchlich [30] [31] [32] [33]. Insbesondere in der prospektiv angelegten Studie von Blankenburg et al. waren bei 240 Patienten mit Stadium I NSCLC präoperativ erhöht gemessene Werte von CEA, CYFRA 21–1 und TMI nicht signifikant mit einem verkürzten Überleben assoziiert [32]. Möglicherweise sind aber nicht präoperativ erhöhte Werte ausschlaggebend für die Prognose, sondern der fehlende postoperative Abfall [33].

Die aktuelle Evidenzlage muss jedoch insgesamt als zu schwach beurteilt werden, um eine allgemeine Empfehlung für den Einsatz von Blutbiomarkern bei NSCLC abgeben zu können. Dementsprechend wird der Einsatz von Biomarkern bei NSCLC in den amerikanischen Richtlinien (ACCP) zurzeit nur innerhalb von klinischen Studien empfohlen [34]. Demgegenüber ist bei neuroendokrinen Tumoren der Lunge (Karzinoidtumoren) die Bestimmung des Chromogranin A als postoperativer Verlaufsparameter wahrscheinlich sinnvoll, wobei sich die Europäischen (ESMO) und ACCP-Empfehlungen diesbezüglich uneinig sind [34] [35]. Es bleibt abzuwarten, ob sich andere im Blut messbare (epigenetische oder miRNA) Biomarker in Zukunft für diagnostische und prognostische Zwecke einsetzen lassen. Immerhin sind die ROC-Analysen (AUC, „Area Under Curve“) für Marker-Kandidaten (SHOX-2: 0,78 [0,74 – 0,84]; miRNA: 0,90 [0,83 – 0,97]) vielversprechend [36] [37].

Volatile Biomarker in der Ausatemluft

In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass Hunde in der Ausatemluft eines Menschen mit hoher Sicherheit riechen können, ob dieser ein Lungenkarzinom hat [38].

Die Ausatemluft beinhaltet Hunderte verschiedener volatiler Substanzen, hierzu zählen ein- und dann wieder ausgeatmete Stoffe, über die Haut aufgenommene Stoffe, wie auch Substanzen, die bei endogenen metabolischen Prozessen entstehen [39].

Volatile Substanzen können mittels Gaschromatografie/Massenspektrometrie sowie anhand von Ionenmobilitätspektrometrie in der Ausatemluft nachgewiesen werden. Zudem ist die Untersuchung der Ausatemluft mit der „elektronischen Nase“ möglich. Im Gegensatz zu den erst genannten Methoden wird hierbei das Verfahren der Mustererkennung angewendet, die Erkennung von Einzelsubstanzen ist nicht möglich [40].

Welche volatilen Substanzen von Hunden gerochen werden, ist bisher nicht bekannt [40]. Jedoch gibt es erhöhte Konzentrationen volatiler Substanzen in der Umgebungsluft von Tumorgewebeproben [41]. Massenspektrometrisch ließen sich bei 97 Patienten mit gesichertem Lungenkarzinom signifikant erhöhte Konzentrationen von 2-Butanon, 2-Hydroxyacetaldehyd, 3-Hydroxy-2-Butanon und 4-Hydroxyhexenal in der Ausatemluft im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe nachweisen [42]. Auch bei der seitengetrennten Messung über das Bronchoskop zeigten sich bei Tumorpatienten unterschiedliche Zusammensetzungen der Ausatemluft [43]. Diese Forschungsansätze sind vielversprechend. Untersuchungen an größeren Patientenzahlen mit Lungenkarzinomen unterschiedlicher Entitäten sind allerdings erforderlich.

Prädiktive Biomarker für eine Therapie mit EGFR- oder ALK-Therapeutika

Entsprechend den aktuellen Richtlinien der International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) oder der European Society of Medical Oncology (ESMO) sollen Epidermal Growth Factor-Receptor (EGFR)-Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) wie z. B. Afatinib, Erlotinib oder Gefitinib als Erstlinientherapie bei Patienten eingesetzt werden, die an einem Adenokarzinom der Lunge oder einem Karzinom mit drüsiger Partialdifferenzierung erkrankt sind und deren Tumoren Mutationen im EGFR-Gen aufweisen [44].

Deshalb sollte bei allen Patienten mit diesen histologischen Subtypen das Vorliegen einer EGFR-Genmutation in den Exonen 19 und 21 per Sequenzanalyse getestet werden, da mehr als 90 % aller EGFR-Mutationen in diesen beiden Exonen zu finden sind [45].

Wird allerdings ein EGFR-Wildtypstatus vorgefunden, so können die Patienten den größten therapeutischen Nutzen von einer konventionellen Chemotherapie erwarten, die in diesem Fall den EGFR-TKI überlegen ist. Das Vorliegen anderer, zu einer Aktivierung des Signalwegs führenden Genmutationen (beispielsweise KRAS- oder BRAF-Genmutationen, MET-Genamplifikationen) wird in der Regel nicht überprüft, da bisher keine gegen diese Zielstrukturen gerichteten Therapeutika zugelassen sind. Bei diesen molekularen Abnormalitäten handelt es sich aber auch um prädiktive Biomarker, obwohl es an prospektiven Validierungen mangelt [46].

Im Regelfall profitieren Patienten mit EGFR-Genmutationen von einer zielgerichteten Therapie mit EGFR-TKI. Wenn jedoch während der Erstlinientherapie kein Ansprechen beobachtet werden kann (primäre Resistenz) oder nach einem initialen Ansprechen eine Progredienz der Tumorerkrankung vorliegt (erworbene Resistenz), können Genmutationen in den Exonen 18 und 20 vorliegen, auf die dann getestet werden sollte. Eine Überprüfung auf das Vorliegen dieser eher seltenen Mutation wird bei der Erstdiagnose nicht empfohlen, da diese Genmutationen und die damit einhergehenden Resistenzen häufig erst während oder nach der Therapie mit konventionellen Zytostatika oder TKI auftreten [47].

KRAS-Genmutationen, die neben der EGFR-Genmutation nahezu exklusiv vorliegen, sind anscheinend nicht mit dem Krankheitsverlauf bei einer Therapie mit Cetuximab assoziiert, obwohl KRAS-Genmutationen typischerweise zu einem Therapieversagen bei einer zielgerichteten Therapie mit EGFR-TKI führen [48].

HER2-Mutationen, die beim NSCLC eher selten vorgefunden werden, können auch primäre oder erworbene Resistenzen gegenüber EFGR-TKI verursachen. Damit handelt es sich bei den HER2-Mutationen nicht nur um eine neue Zielstruktur für die nächste Generation der EGFR-TKI, sondern auch um einen prädiktiven Biomarker [49].

Des Weiteren können in ungefähr 5 % der pulmonalen Adenokarzinome ALK-EML4-Translokationen nachgewiesen werden. In diesen Fällen erwies sich die Therapie mit dem dualen ALK- und MET-TKI Crizotinib gegenüber einer Kombinationschemotherapie als deutlich überlegen. Standard in der ALK-Diagnostik ist die FISH-Untersuchung, welche sich allerdings recht aufwendig gestaltet und ein hohes Maß an Expertise verlangt. Einfacher erscheint daher ein vorheriges Screening mittels ALK-Immunhistochemie. Der ALK-Antikörper erfasst eine Überexpression des ALK-Fusionsproteins und zeigt eine hohe Übereinstimmung mit der FISH-Untersuchung. In einer Studie mit 186 FISH-positiven Fällen zeigten nur drei Fälle immunhistochemisch ein negatives Ergebnis [50].

Daher sollten Patienten mit Adenokarzinomen bezüglich einer ALK-EML4-Translokation zunächst mittels IHC auf eine ALK-Expression untersucht werden.

Prädiktive Biomarker für eine Therapie mit konventionellen Zytostatika

Für die Chemotherapie mit konventionellen Zytostatika wie Antifolaten oder Platinderivaten gibt es bisher keine validierten prädiktiven Biomarker.

Die Expression der Thymidylat-Synthase (TS) scheint ein prädiktiver Biomarker für eine Chemotherapie mit Pemetrexed zu sein. Einerseits scheint eine niedrigere Expression auf dem mRNA- und/oder dem Proteinlevel mit einem guten objektiven Ansprechen und andererseits einem längeren progressionsfreien Überleben sowie einem verlängerten Gesamtüberleben zu korrelieren [51].

Wegen des Fehlens prospektiver Studien wird die prädiktive Funktion dieses Biomarkers immer noch kontrovers diskutiert, wenn auch erste Ergebnisse aus prospektiven Studien den Zusammenhang zwischen der mittels IHC bestimmten Proteinexpression und dem Gesamtüberleben zu bestätigen scheinen [52].

Es ist bekannt, dass die Expression des Excision Repair Cross-Complementation Group 1 (ERCC1)-Gens ein prädiktiver Biomarker für eine Therapie mit Platinderivaten bei verschiedenen Tumoren ist. In einer Metaanalyse verschiedener pro- und retrospektiver Studien konnte nachgewiesen werden, dass eine erhöhte Expression des DNA-Reparatur-Enzyms ERCC1 mit einem verkürzten Überleben und einem schlechteren Ansprechen der NSCLC-Patienten auf eine platinhaltige Chemotherapie assoziiert ist [53].

Ähnlich wie für ERCC1 wird auch für das Enzym Ribonukleotid-Reduktase M1 (RRM1) eine prädiktive Funktion für eine Chemotherapie mit Gemcitabin diskutiert [54].

Trotz der guten prädiktiven Eigenschaften der ERCC1 – und RRM1-Expression in verschiedenen retrospektiven Studien, bei denen immunhistochemische und/oder molekularpathologische Techniken eingesetzt wurden, verlief eine prospektive klinische Phase III-Studie, bei der die Patienten der Biomarker-Expression in ihren Tumoren entsprechend verschiedene Zytostatika-Kombinationen erhielten, negativ, d. h. die Biomarker-adaptierte Chemotherapie führte zu keinem verbesserten PFS oder OS [55].

Ausblick

Prätherapeutische Biomarker haben ein großes Potenzial, die Behandlung des Lungenkarzinoms zu verbessern. Es haben aber bisher nur wenige prädiktive Biomarker ihren Weg in die klinische Praxis geschafft. Enorme Anstrengungen werden unternommen, um weitere Substanzen zu etablieren, welche die Therapie und damit die Prognose von Patienten mit Lungenkarzinom verbessern können. Fortgeschrittene Tumorstadien werden heutzutage minimalinvasiv bronchoskopisch diagnostiziert, sodass meist nur wenig Probenmaterial zusätzlich zur histologischen Diagnosestellung zur Verfügung steht. Von besonderer Bedeutung ist daher ein optimal abgestimmter Prozess von der bronchoskopischen Probenentnahme über die Probenbehandlung bis zur Probenanalyse unter Einbeziehung aller betroffenen Berufsgruppen.

Interessenkonflikt

Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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