Identifizierung von Mutationsprofilen hereditärer BRCA1-assoziierter TNBCs

Zielsetzung:

Das triple-negative Mammakarzinom (TNBC) ist eine aggressive Brustkrebsform mit ungünstiger Prognose, welche immunhistochemisch durch Fehlen der Rezeptoren für Östrogen und Progesteron sowie einen negativen HER2/neu-Status definiert ist, sich molekulargenetisch jedoch als heterogene Erkrankung präsentiert. Rund 15% der TNBCs können mit einer prädisponierenden Keimbahnmutation in BRCA1 oder BRCA2 in Verbindung gebracht werden. Anhand der Mutationsprofile von BRCA1-assoziierten TNBCs sollen weitere potentiell an der TNBC-Tumorgenese und -progression beteiligte Gene identifiziert werden.

Methodik:

Aus archivierten TNBC-Gewebeproben von BRCA1-Mutationsträgerinnen wurde invasivtumoröses Gewebe makrodissektiert und DNA extrahiert (GeneRead DNA FFPE; Qiagen). Nach qPCR-basierter Bestimmung der DNA-Qualität (QIAseq DNA QuantiMIZE; Qiagen) wurden NGS-Libraries mit dem 93-Gen Human Breast Cancer QIASeq DNA Panel v3 (Qiagen) generiert, welches mittels einzigartiger molekularer Indices (Unique Molecular Identifier; UMIs) einen Nachweis auch niedrig frequenter Varianten ermöglicht. Proben- Libraries wurden per qPCR quantifiziert und auf einem MiSeq-System (Illumina) sequenziert. NGS-Daten wurden mit der Online- Anwendung QIAseq Targeted Sequencing Data Analysis Portal (Qiagen) hinsichtlich SNV/InDels analysiert.

Ergebnisse:

Aktuell sind 59 von insgesamt 98 TNBC-Gewebeproben aufgearbeitet. Hiervon zeigten 96% einen ausreichenden Tumorzellanteil (> 30%). Die Qualitätsüberprüfung isolierter DNA mittels qPCR ergab in 86% der Proben (51/59) eine zur weiteren Analyse per NGS geeignetes Material. Für die derzeit sechs analysierten Tumorproben wurden im Mittel 6 Millionen NGSReads pro Probe mit 96,7% Reads on target erzielt. Die mittlere Abdeckung betrug rund 700 UMIs pro Base, wobei 98% der Basen mit > 100 UMIs sequenziert werden konnten. Pro Tumor wurden im Schnitt 212 SNVs und 3 InDels mit einer VAF > 10% (Varianten-Allelfrequenz) detektiert. Die Gesamtvarianten-Profile der sechs Proben waren hierbei vergleichbar. In ersten Analysen hinsichtlich (potentiell) pathogener Tumor-Mutationen konnte die jeweilige BRCA1-Keimbahnmutation in fünf Tumorproben detektiert werden. Die Überprüfung in der verbleibenden Tumorprobe war wegen methodischen Einschränkungen nicht möglich. Die Mehrheit der Tumorproben wies zudem inaktivierende Mutationen in KMT2C (5/6) und TP53 (5/6) auf.

Schlussfolgerung:

Mittels breiter Mutationsanalyse ermöglicht der etablierte Workflow, BRCA1 assoziierte Veränderungen in potentiell an der Tumorgenese und -progression des TNBC beteiligten Genen zu identifizieren. Um das Spektrum nachweisbarer Mutationen noch zu verbreitern, ist aktuell eine zusätzliche Proben-Analyse mit dem 170-Gen-Panel TruSight Tumor 170 (Illumina) in Arbeit, welches neben einem erweiterten Gen-Set auch eine parallele Analyse auf RNA-Ebene erlaubt.