Präimplantationsdiagnostik zum Ausschluss von Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom: Etablierung eines Allel-spezifischen Multiplex-PCR basierten Assays für das SBDS-Gen

Zielsetzung Das Shwachman-Bodian-Diamond-Syndrom (SBDS) ist eine seltene autosomal-rezessive Blutbildungstörung und nach der Mukoviszidose zweihäufigste Ursache für eine exokrine Pankreasinsuffizienz bei Kindern. Die Erkrankung wird durch pathogene Varianten im SBDS-Gen (7q11.21) verursacht. In dreiviertel der Fälle entstehen diese Varianten durch Genkonversion mit dem Pseudogen SBDSP1, einer zu 97% identischen, nicht funktionellen Kopie des SBDS-Gens. Unser Ziel war es, eine robuste SBDS-spezifische Präimplantationsdiagnostik (PGT) zu etablieren.

Materialien Die Mutter der Indexpatientin ist Anlageträgerin der Klasse-5-Variante SBDS:NM_016038.4:c.183_184delinsCT (Klasse 5) und bei dem Vater liegt die Klasse-5-Variante SBDS:NM_016038.4:c.258+2T>C in heterozygoter Form vor. Das familienspezifische System wurde an gDNA von 7 Familienmitgliedern und mehr als 40 Einzelzellen des Paares getestet.

Methoden Zur indirekten Diagnostik wurden 30 STR-Marker in der Nachbarschaft des SBDS-Gens und SBDSP1 genotypisiert. Für den direkten Nachweis wurden zwei Strategien verglichen: gezielte Amplifikation des SBDS-Gens (A: Amplikonlänge 458 bp) und parallele Amplifikation von SBDS und SBDSP1 (B: Amplikonlänge: 286 bp) gefolgt von Allel-spezifischer PCR und Minisequenzierung.

Ergebnisse Für die indirekte Diagnostik wurden 14 STR-Marker, dabei auch bisher nicht publizierte Marker, ausgewählt. Aufgrund deutlich niedrigeren ADO-Raten und Amplifikationsversagen wurde für den direkten Nachweis Strategie B verfolgt. Pro Variante wurden 3-4 SNAP-Primer getestet und jeweils der Primer mit höchster Spezifität selektiert. Der Assay erfüllt alle ESHRE Akzeptanzkriterien.

Zusammenfassung Unser Allel-spezifisches PGT-System erlaubt zuverlässige Amplifikation von Varianten im SBDS-Gen und deren Unterscheidung von SBDSP1-Varianten. Zusätzliche Sicherheit und Detektion von Rekombinationsereignissen wird durch parallele Analyse benachbarter STR-Marker gewährleistet. Die Effizienz von Multiplex-PCR an Einzelzellen ist von der Amplikonlänge abhängig. Das Paar befindet sich zurzeit in reproduktionsmedizinischer Behandlung.

Interessenkonflikt

Ich erkläre als korrespondierender Autor, dass meine Koautoren mir mitgeteilt haben, dass sie während der letzten 3 Jahre keine wirtschaftlichen oder persönlichen Verbindungen im oben genannten Sinne hatten. Auch ich selbst hatte keine derartigen Verbindungen in den letzten 3 Jahren.

Publication History

Article published online:
11 October 2022