Patch-Clamp-Untersuchungen an rekombinanten GABA_A-Rezeptoren mittels ultraschnellem Applikations-System

Die Patch Clamp-Technik besteht darin, dass entweder ein Membranstück („Flicken” = patch) oder eine ganze Zelle (Whole-cell Patch) auf eine feinst ausgezogene Glaspipette (Patch-Pipette) aufgenommen wird. Entwickelt wurde dieses Verfahren Mitte der 70er Jaher von Erwin Neher und Bert Sakmann am Max-Planck-Institut für Psychiatrie in München (Nobelpreis 1991). Mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik war es erstmals möglich, elektrische Signale auf Zellmembranebene zu registrieren. Insbesondere lassen sich membranständige Ionenkanäle funktionell erfassen. Gemessen werden hierbei transmembranäre Ionenströme. Das Prinzip der Apparatur besteht in einer Messelektrode und einer Referenzelektrode, die durch die Zellmembran elektrisch getrennt sind.

Was die eigentliche Patch-Technik betrifft, lassen sich zunächst zwei wichtige Formen einer Patch unterscheiden: Die Outside-out- und die Whole-Cell Patch (Abb. [1]). Welchen Patchmodus man wählt, hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. Art des Zellmaterials, Adhärenzeigenschaft der Zellen, Art des Ionenkanals und methodologischem Setup.

Zelluläre Ionenkanäle sind aus mehreren transmembranären Protein-Untereinheiten aufgebaut und können einen offenen bzw. geschlossenen, d. h. für ein (meist) Kanal-spezifisches Ion passierbaren bzw. unpassierbaren Zustand annehmen. Je nach „Öffnungs-Trigger” lassen sich Spannungs-abhängige, wie z. B. Natrium-Kanäle, von Liganden-abhängigen Kanälen, sog. Rezeptor-gekoppelten Kanälen, unterscheiden. Liganden-abhängige Kanäle wiederum lassen sich als Kationen-spezifisch (und somit exzitatorisch wirksam), wie z. B. glutamaterge Rezeptoren, Serotonin (5-HT₃)-Rezeptoren oder nikotinische Azetylcholin-Rezeptoren, oder als Anionen-spezifisch (und damit inhibitorisch), wie z. B. Glycin-Rezeptoren und GABA_A-Rezeptoren (historisch: Benzodiazepin-Rezeptoren), klassifizieren. Unzählige pharmakologisch und toxikologisch bedeutsame Substanzen und nicht wenige erbliche Erkrankungen haben Ionenkanäle als Wirkort. Erst die Patch-Clamp-Technik ermöglichte hierbei einen fundierten experimentellen Zugang. Gerade vom anästhesiologischen Standpunkt aus ergeben sich daraus interessante Ansätze zur Untersuchung der Wirkung von Anästhetika auf molekularer Ebene.

Klinisch wirksame Anästhetika gehören den unterschiedlichsten Stoffgruppen an. Hierbei reicht das Spektrum von Edelgasen wie Xenon über Lachgas, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Barbiturate und Diisopropylphenol bis hin zu Steroiden. Derzeit gelten Liganden-abhängige Ionen-Kanäle an den Knotenpunkten des neuronalen Informationsflusses als wichtige Schlüsselstellen für die Vemittlung der anästhetischen Wirkung. Unter ihnen wird besonders dem GABA_A-Rezeptor-System, welches die inhibitorischen zentralnervösen Funktionen dominiert, besonderes Interesse entgegengebracht.

Für einige Anästhetika (Benzodiazepine, Barbiturate, Etomidate, Propofol, volatile halogenierte Kohlenwasserstoffe) konnte in den letzten Jahren der Nachweis einer Beeinflussung des GABA_A-Rezeptors im Sinne einer Erhöhung des zellulären Chlorid-Influx durch den Rezeptorkanal erbracht werden [1] [2] [3] [4]. Die Induzierung von Sedierung, Hypnose oder Anästhesie durch die genannten Substanzen kann also zumindest teilweise durch eine Verstärkung des inhibitorischen GABA_A-Rezepor-Systems erklärt werden.

Inhalt unserer Arbeiten ist seit einiger Zeit die Wirkung von N₂O und Xenon auf den GABA_A-Rezeptor. Für diesen experimentellen Ansatz war zunächst die Schaffung geeigneter Modelle notwendig. Als Modell für ein GABA_A-Rezeptoren tragendes Neuron dient die etablierte Kulturzellinie HEK 293 (human embryonal kidney, „HEK”), die in nativer Form keine GABA-Rezeptoren exprimiert. Aus Rattenhirnen wird cDNA für definierte Untereinheiten des GABA_A-Rezeptors rekombinant gewonnen und in als Transfektionsvektor dienende Plasmide eingebaut. In den zentralen Neuronen liegt der pentamere GABA_A-Rezeptor überwiegend in der Untereinheiten-Zusammensetzung α₁β₂γ₂ vor [5] [6]. Mittels Elektroporation werden nun drei verschiedene Plasmide (Vektoren), die entsprechend für diese Untereinheiten α₁, β₂ und γ₂ codierende cDNA tragen, in HEK 293-Zellen eingeschleust. Dieser Vorgang heisst Transfektion. Bei der Elektroporation werden die Zellen für ca. 40 ms einem elektrischen Feld ausgesetzt, das die Zellmembranen für die Diffusion der Plasmide in die Zellen hinein kurz durchlässig macht. Ab etwa 4 - 8 Stunden nach Transfektion exprimieren die Zellen vorübergehend (für ca. 20 - 40 h) den entsprechenden α₁β₂γ₂ GABA_A-Rezeptor. Die Registrierung der von GABA als physiologischem Transmitter induzierten Ströme erfolgt schließlich mittels Patch-Clamp-Technik im Whole-Cell-Modus (Abb. [1]). Die mit einem speziellen Verstärker abgeleiteten Ströme werden digitalisiert und aufgezeichnet.

Als Modell für die synaptische Transmitter-Freisetzung dient ein in der eigenen Arbeitsgruppe entwickeltes Piezo-getriebenes Applikations-System (Abb. [2]), mit dem ein kompletter Lösungswechsel in der Rezeptor-Sphäre der Whole-Cell-Patch innerhalb ca. 1 ms möglich ist [7]. Zusammen mit der Hintergrundlösung befindet sich die Testlösung (mit dem Agonisten GABA) in laminarem Flow. Dadurch bildet sich zwischen Hintergrund- und Testlösung ein sehr scharfer Übergang. Die GABA-Applikation bzw. -Desapplikation erfolgt nun dadurch, dass die Testlösung Piezo-Kristall-getrieben an die Patch heran bzw. von der Patch weg geführt wird. Sind auf der Patch genügend viele Rezeptor-Kanäle exprimiert, kann ein GABA-induzierter Strom registriert werden.

Zur Untersuchung der Wirkung gasförmiger Anästhetika auf den GABA_A-Rezeptor ist es erforderlich, das jeweilige Gase in Lösung zu bringen. Sobald sich die Patch in der zur Messung erforderlichen Position innerhalb des Applikationssystems befindet, wird die mit z. B N₂O gesättigte Testlösung (mit definierter GABA-Konzentration) appliziert.

Im folgenden Beispiel (Abb. [3]) erhöht N₂O reversibel die Stromamplitude von -234 pA auf -413 pA. Die Stromanstiegszeit, die ein Maß für GABA-Bindungsrate bzw. Kanal-Öffnungs-Rate darstellt, verkürzt sich unter N₂O gleichzeitig von 179 ms auf 106 ms [8]. Diese Messergebnisse deuten darauf hin, dass N₂O die inhibitorische GABA-Wirkung im ZNS verstärken könnte. Neben einer bereits beschriebenen Blockierung des exzitatorisch wirksamen NMDA-Rezeptors [9] könnte dadurch die anästhetische Wirkung von N₂O mitbegründet sein.

An diesem Beispiel wird deutlich, wie sich die beschriebene Methode zur Untersuchung der Anästhetika-Wirkung an einzelnen Rezeptoren einsetzen lässt. In Zusammenschau mit den Ergebnissen anderer Untersuchungstechniken (z. B. Stopped-Flow-Fluoreszenz) leistet die Patch-Clamp-Technik zweifellos einen wesentlichen Beitrag zu den derzeit akzeptierten Modellvorstellungen über die Wirkung von Anästhetika auf zellulärer Ebene.

Literatur

• 1 Jones M V. et al . Enhancement of gamma-aminobutyric acid-activated CI-currents in cultured rat hippocampal neurones by three volatile anaesthetics.  J. Physiol.. 1992;  449 279-293
• 2 Lin L H. et al . Molecular determinatns of general anesthetic action: role of GABA_A receptor sturcture.  J. Neurochem.. 1993;  60 1548-1552
• 3 Krasowsky M D. et al . Propofol and other intravenous anesthetics have sites of action on the γ-aminobutric acid type A receptor distinct from that for isoflurance.  Mol. Pharmacol.. 1998;  53 530-538
• 4 Tanelian D L. et al . The role of the GABA_A receptor/cloride channel complex in anaesthesia.  Anesthesiology. 1993;  78 757-776
• 5 Chang Y. et al . Stoichiometry of a recombinant GABA_A receptor.  J. Neurosci.. 1996;  16 5415-5424
• 6 Möhler H. et al .The GABA_A receptors: from subunits to diverse functions. In: Narahashi T (ed) Ion Channels Plenum Press, New York 1996 4: 89-110
• 7 Franke Ch. et al . Liquid filament switch for ultra-fast exchanges of solutions at excised patches of synaptic membrane of crayfish muscle.  Neurosci. Lett.. 1987;  77 199-204
• 8 Hapfelmeier G. et al . N₂O induces a leftward shift in the GABA response at recombinant GABA_A receptors (GABA_AR).  Anesthesiology. 1999;  91 ((3 A)) A 796
• 9 Jevtovic-Todorovic V. et al . Nirous oxide (laughing gas) is an DNMDA antagonist, neuroprotectant and neutrotoxin.  Nature Med.. 1998;  4(4) 460-463