Einleitung
Einleitung
Die Aminosäure Arginin ist aus kosmetischer und dermatologischer Sicht eine vielversprechende
Wirksubstanz im Hinblick auf die topische Anwendung. Die Potenz der Substanz lässt
sich auf die komplexe metabolische Einbindung des Arginins in den Zellstoffwechsel
und die günstigen physikochemischen Eigenschaften zurückführen [10]
[11]. Von besonderem Interesse sind dabei spezifische und unspezifische Wechselwirkungen
des Arginins mit Keratinozyten. Arginin kann enzymatisch durch Arginase zu Harnstoff
metabolisiert werden [11]. Harnstoff erhöht die Wasserbindungskapazität der Epidermis und trägt somit entscheidend
zur Barrierefunktion des Epithels bei [31]. Darüber hinaus dient Arginin als Substrat für die enzymatische Synthese von Stickstoffmonoxid
(NO) über die NO-Synthase. NO ist wesentlich an der Regulation der hämo- und lymphovaskulären
Perfusion sowie der Initiation und Unterhaltung von Entzündungsprozessen beteiligt
[11].
Über die Möglichkeit der topischen Anwendung von Arginin sind bisher wenige Daten
publiziert. Von besonderem Interesse ist dabei die Klärung der Interaktionen des Wirkstoffs
mit der Epidermis, die Objektivierung der Penetrationsdynamik und -kinetik sowie die
Untersuchung der Haut- und Schleimhauttoxizität und der klinischen Wirksamkeit als
Voraussetzung für den kosmetischen und prophylaktischen Einsatz in Dermatika.
Chemie des Arginins
Chemie des Arginins
Wie bei allen Aminosäuren besteht die Basisstruktur von Arginin (2-Amino-5-guanidovaleriansäure)
aus einer Aminogruppe (NH2), einer Carboxylgruppe (COOH) und einem am 2. Kohlenstoffatom gebundenen Wasserstoffatom
[11]. Arginin zählt zusammen mit Lysin und Histidin zur Gruppe der Diaminomonocarbonsäuren
und trägt eine zusätzliche basische Gruppe in der Seitenkette (Abb. [1]).
Abb. 1 Strukturformel von Arginin (C6H15N4O2; MG 174,2).
Arginin löst sich leicht im Wasser. Der Schmelzpunkt liegt bei 238 °C und die spezifische
Drehung bei 20 °C im Natriumlicht beträgt 27,4°. Bei Zimmertemperatur liegt Arginin
als weißes kristallines Pulver vor [11]. Arginin befindet sich physiologisch in der optischen L-Konfiguration, zählt zu
den glukoplastischen, nichtessenziellen Aminosäuren und kann somit vom Menschen endogen
synthetisiert werden. Gleichwohl ist bekannt, dass bei extremen Verhältnissen (z.
B. Schock, Sepsis, Wachstum) die endogene Synthese einiger nichtessenzieller Aminosäuren,
so auch Arginin, aufgrund eines Stickstoffdefizits nicht ausreichend sein kann. Deshalb
spricht man auch von „bedingt essenziellen” Aminosäuren.
Arginin und seine biochemische Bedeutung
Arginin und seine biochemische Bedeutung
Arginin wurde erstmals von Schulze und Steiger 1866 in kristalliner Form isoliert.
Etwa 10 Jahre später konnte das Vorkommen in tierischem Gewebe nachgewiesen werden.
Es wurde erkannt, dass Arginin eine wesentliche Bedeutung im Zusammenhang mit Wachstumsvorgängen
und bei der Regulation des Stickstoffmetabolismus hat. Arginin wird intrazellulär
durch Proteolyse und im Harnstoffzyklus aus Argininsuccinat in der Argininsuccinase-Reaktion
synthetisiert. Arginin ist ein essenzieller Cofaktor für die Pyrimidinsynthese [10] und dient als Precursor der Polyaminsynthese (Spermin, Spermidin) [26]. Darüber hinaus kann L-Arginin die Freisetzung von verschiedenen Hormonen, insbesondere
Pankreashormonen, bedingen [6].
L-Arginin ist neben der Protein- und der Kreatinsynthese das Substrat zweier bedeutsamer
enzymatischer Reaktionen (Abb. [2]):
A. Arginase-Reaktion [14]Das Enzym Arginase setzt L-Arginin zu Harnstoff und L-Ornithin um. L-Ornithin wiederum
kann durch die Ornithincarbamoyltransferase im Harnstoffzyklus zu L-Citrullin metabolisiert
werden oder steht für die Polyaminsynthese zur Verfügung.
B. Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase-Reaktion [7]
[11]
[16]
[19]Hierbei wird aus L-Arginin, katalytisch durch NO-Synthase gesteuert, NO und L-Citrullin
synthetisiert. L-Citrullin ist ein Substrat für den Citrat- und den Harnstoff-Zyklus.
Von besonderem Interesse sind die Wechselwirkungen der NO-Synthase mit der Arginase
(A2). Fest steht, dass beide Enzyme um das Substrat L-Arginin physiologisch konkurrieren
und sich somit zwangsläufig beeinflussen. Die Arbeitsgruppe um L. J. Ignarro [4] beschrieb die Substratabhängigkeit beider Enzyme. Durch Applikation von NG-hydroxy-L-Arginin (NOHA), einem potenten Inhibitor der Arginase, konnte die NO-Produktion
durch Aktivierung der iNOS deutlich gesteigert und die Harnstoffsynthese vermindert
werden. Umgekehrt zeigte sich bei Applikation von NG-methyl-L-Arginin, einem selektiven Blocker der iNOS, eine Steigerung der Harnstoff-
und eine Senkung der NO-Synthese. Gotoh et al. [8] berichteten über eine Hemmung der NO-Synthase durch Arginase (A2), konnten aber
auf mRNA-Ebene keine gewebeeinheitlichen Effekte nachweisen. Sie fanden in verschiedenen
extrahepatischen Organen eine unterschiedlich starke Expression der Arginase (A2)
und postulierten gewebe- und altersspezifische Regulationsabläufe, die wesentlich
von der Stärke der Expression der Arginase (A2) abhängen. Vergleichend zu venösen
Ulcera crurum untersuchten Abd El Aleem et al. [1] die Aktivität der Arginase und der NOS an gesunder Haut. Sie stellten fest, dass
die Aktivität beider Enzyme in den Ulzera vermindert war und schlussfolgerten einen
ursächlichen Zusammenhang, der die Wundheilungsstörung bedingt. Dies wird durch die
Untersuchungen von Jude et al. [15] aus derselben Arbeitsgruppe um Ferguson unterstützt, die ebenfalls eine Aktivitätsminderung
beider Enzyme bei diabetischen Fußulzera fanden. Sie vermuteten darüber hinaus einen
Zusammenhang mit einer lokal erhöhten TGF-β1-Konzentration. Louis et al. [18] wiesen auf mRNA-Ebene eine vermehrte Expression unter Hyperoxie und eine Suppression
der Expression unter Hypoxie nach. Den Einfluss von Lipopolysacchariden (LPS) auf
die Genregulation der Arginase-Isoformen und iNOS untersuchten Salimuddin et al. [24]. Sie wiesen eine zeitliche Differenz der Aktivierung der Arginase-Isoformen nach
und schlussfolgerten einen Zusammenhang der Arginase-Regulation mit der NO-Synthese.
L-Arginin kommt eine Schlüsselfunktion bei der Bildung und Aufrechterhaltung der epidermalen
Barrierefunktion zu. Es dient als eine wichtige Harnstoffquelle für die Epidermis
und bestimmt somit indirekt entscheidend die Hydratation des Stratum corneum. In der
gleichen enzymatischen Reaktion wird L-Ornithin als Precursor der Polyaminsynthese
gebildet. Polyamine sind niedermolekulare Substanzen (z. B. Spermidin, Spermin), die
in nahezu allen humanen Zellen nachweisbar sind. Ihnen wird eine zentrale Rolle bei
der Stimulation der Zellproliferation, dem Gewebewachstum und der Differenzierung
zugeschrieben [26].
L-Arginin trägt weiterhin durch die Generierung von NO zur Regulation des hämo- und
lymphovaskulären Systems bei [3]
[16]. Es ermöglicht die bedarfsgerechte Verteilung und das Recycling von Blutgasen, Nährstoffen
und Flüssigkeit. NO verfügt darüber hinaus über eine Vielzahl weiterer Wirkungen,
deren physiologisches und pathophysiologisches Zusammenspiel noch nicht vollständig
geklärt ist.
Die biochemische Bedeutung von L-Arginin reicht über die beschriebenen Hauptreaktionen
hinaus. L-Arginin reguliert über die Pyrimidinsynthese die Bildung von Pyrimidinnukleotiden,
die essenziell für die DNA- und RNA-Synthese sind [10]. Des Weiteren besitzt L-Arginin eine direkte oder indirekte Wirkung auf die Freisetzung
von Hormonen. So haben Dupré et al. [6] eine insulinstimulierende Wirkung, Merimée et al. [21] den Einfluss auf die Freisetzung von hypophysären Hormonen und Imms et al. [12] den Anstieg von Katecholaminen nach L-Argininstimulation beschrieben.
Arginin im Harnstoffzyklus (Arginase-Reaktion)
Arginin im Harnstoffzyklus (Arginase-Reaktion)
Im Harnstoffzyklus von Hepatozyten wird L-Arginin (2-Amino-5-guanidovaleriansäure)
durch das L-Isomer-spezifische Enzym Arginase (A1, Typ I) zu L-Ornithin und Harnstoff
hydrolytisch gespalten (Abb. [3]).
Neben der Arginase Typ I (A1), der so genannten hepatischen oder konstitutiven Form
(MG 38,9 kDa) ist eine zweite Isoform, der Typ II (A2), die extrahepatische oder die
durch Lipopolysaccharide (LPS) induzierbare Form (MG 39,8 kDa) bekannt [8]
[9]
[14]. Die ersten Berichte über eine epidermale Arginase stammen von Roberts und Fränkel
(1949). Rothberg (1958) untersuchte die epidermale Arginase mit manometrischen Methoden
und stellte fest, dass das Enzym weitgehend an hochmolekulare Substanzen gebunden
ist und nur zu einem geringen Teil in gelöster Form vorliegt.
Intraepidermal wird Harnstoff durch Keratinozyten aus L-Arginin neosynthetisiert.
Diese exprimieren die L-isomerspezifische Arginase (AII, Typ II) in Mitochondrien.
Die Hydrolase ist spezifisch und besitzt eine hohe Aktivität. Sie liegt weitgehend
als Desmoenzym vor und ist somit an hochmolekulare unlösliche Träger gebunden. Im
Vergleich zu anderen Organen und Kompartimenten enthält die Epidermis den größten
prozentualen Anteil an Arginase. Die extrahepatische Isoform der Arginase unterscheidet
sich von der hepatischen Isoform durch einen nahezu neutralen pI-Wert und durch ein
etwas höheres Molekulargewicht. Die tetramere keratinozytäre Arginase ist ein Metalloenzym
und bindet als Cofaktor Mn2+-Ionen, die das Molekül stabilisieren und die Aktivität regulieren. Kristallographische
Untersuchungen haben deutlich gemacht, dass das Manganzentrum im Arginasemolekül aus
zwei aufeinander abgestimmten Mn2+-Ionen (MnA und MnB) aufgebaut ist. Diese werden durch Wassermoleküle und zwei Aspartatreste
miteinander verbunden. Ein Fehlen der Metallionen bewirkt eine Dissoziation des Enzyms
in vier inaktive Monomere. Hingegen führt der Zusatz von Mn2+-Ionen zur Steigerung der enzymatischen Aktivität. Das pH-Optimum liegt in Gegenwart
von Mn2+-lonen bei pH 10 [14]. Ab einem pH von ≤ 6 dissoziiert das Tetramer reversibel über Dimere zu inaktiven
Monomeren. Der Km-Wert beider Isoenzyme beträgt für L-Arginin 12 - 14 mM [14].
Die essenzielle Bedeutung der Argizase (A2) für den Menschen wiesen Mendez et al.
[20] nach, die durch die selektive Blockade der uterinen Arginase mit 2-Amino-5-Iodoacetamidvaleriansäure
(AIAVA) bei trächtigen Ratten eine erhebliche intrauterine Entwicklungsretardierung
der Embryonen feststellten und Chamorro et al. [5], die bei Blockade der Arginase (A2) mit (+)-S-2-Amino-6-Iodoacetamidohexansäure
(2-AIHA) über einen Fertilitätsverlust und Neoplasien berichteten.
Darüber hinaus beschrieb Ratner [23], dass Carbomylphosphat, welches im Rahmen der Pyrimidinsynthese durch Carbomylphosphatsynthase
I (CPSI) produziert wird, für die Harnstoffsynthese in der Leber von Bedeutung ist.
Ob dieser für die Arginase (A1) beschriebene Effekt auch für die Arginase (A2) von
Bedeutung ist, bleibt unklar.
Durch Inkubation von Keratinozytenkulturen (HaCaT und native Keratinozyten) mit unterschiedlichen
Konzentrationen von L-Arginin konnten wir im Westernblot keine vermehrte Expression
des Arginase-Proteins feststellen [29]. Bekannt ist aber, dass beispielsweise hormonelle Faktoren eine Expression der Arginase
(A2) bedingen können. Jenkinson et al. [14] konnten nachweisen, dass während der Laktation die Aktivität der mammären Arginase
um den Faktor drei steigt, und mit Westernblot-Technik zeigen, dass dies durch eine
de-novo-Protein-Synthese der Arginase (A2) zu erklären ist. Weiterhin ist bekannt,
dass die Regulation der Aktivität der extrahepatischen Arginase wesentlich über die
intrazelluläre Konzentration von L-Arginin gesteuert wird. Dies belegen die Untersuchungen
von Iyer-Ramaswamy et al. [13], die bei der erblichen Form eines hepatischen Arginasedefizites mit Hyperargininämie
eine deutliche Steigerung der extrahepatischen Arginaseexpression nachweisen konnten.
Ochoa et al. [22] beschreiben, dass von Entzündungszellen produziertes Interleukin 4 (IL-4) und 10
(IL-10) sowie TGF-β und Katecholamine die Aktivität der extrahepatischen Arginase
steigern. Darüber hinaus konnten sie eine Aktivitätssteigerung in extrahepatischem
Gewebe nach Traumatisierungen nachweisen. Nach Gotoh et al. [9] führt Dexamethason in Makrophagen zur Aktivierung der Arginase (A2), während Interferon-γ
(IFN-γ) diese sehr wirksam hemmt.
Von besonderem Interesse im Hinblick auf den Differenzierungsprozess der Keratinozyten
ist die Verteilung des Enzyms innerhalb der Epidermis. Eigene immunhistochemische
Untersuchungen und die digitale Analyse der Bilder zeigen ein Konzentrationsmaximum
im Stratum basale und im unteren Stratum spinosum [29]. Diese Funktionseinheit bildet auch die germinative Zone des verhornenden Plattenepithels.
In Differenzierungsrichtung kommt es zu einer funktionellen und morphologischen Metamorphose
der Keratinozyten bis hin zu Korneozyten im Stratum corneum. Teil dieser Umwandlung
ist der Verlust biochemischer Funktionen, zu denen offensichtlich auch die Fähigkeit
zur Harnstoffsynthese gehört.
Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass L-Arginin im Konzentrationsbereich ≥ 50
mmol/l eine Aktivierung der epidermalen Arginase und damit eine Erhöhung der Harnstoffkonzentration
intra- und extrazellulär bedingt. Dieser Effekt ist abhängig von der Inkubationszeit.
Wir fanden nach 24 Stunden lediglich eine extrazelluläre Erhöhung der Harnstoffkonzentration,
hingegen nach 48 Stunden eine extra- und intrazelluläre Konzentrationssteigerung [29].
Die biologische Bedeutung von Harnstoff für die Hydratation des Stratum corneum und
damit für die Barrierefunktion der Epidermis ist seit langem bekannt [30]. Harnstoff wird als einer der wichtigsten Bestandteile des physiologischen Feuchthaltefaktors
(natural moisturizing factor [NMF]) der Hornschicht angesehen und ist auch im wasserlöslichen
Anteil des Hautoberflächenfilms nachweisbar. Die Einzelbestandteile des NMF, kleine
wasserbindende Moleküle, sind an Korneozyten sowie im Interzellularbereich lokalisiert
und bestimmen die Hygroskopizität des Stratum corneum. Neben Harnstoff sind Na-Lactat,
Na-Pyroglutamat und an Skleroproteine gebundene Kohlenhydrate funktionell bestimmende
Anteile des NMF. Sie werden deshalb aus therapeutischen und kosmetischen Erwägungen
vielfach in externen Zubereitungen als Moisturizer eingesetzt. Dies trifft insbesondere
für Harnstoff zu. Darüber hinaus tragen sie zur Bildung und Aufrechterhaltung des
Säureschutzmantels der Hautoberfläche bei, der bakteriostatische und antimykotische
Eigenschaften aufweist [30]. Dieser Hydrolipidfilm wird wesentlich durch Transpiration und Perspiratio insensibilis
(transepidermal water loss [TEWL]) reguliert [31].
Die externe Substitution von Harnstoff in verschiedenen Grundlagen ist Bestandteil
der Therapie und Prophylaxe (Pflegetherapie) von Dermatosen und pathologischen Hautzuständen
[31]. Die Harnstoffwirksamkeit ist im Wesentlichen davon abhängig, inwieweit in den entsprechenden
Hautschichten ein optimales Konzentrations-Zeit-Profil des penetrierten Harnstoffs
erzielt wird. In Abhängigkeit vom Vehikelsystem sind ca. 80 % der penetrierten Harnstoffmenge
in den äußeren Hornlagen zu finden. In tiefere Hautschichten (vitale Epidermis, Dermis)
penetrieren vergleichsweise geringe Harnstoffmengen [32]. Deshalb werden zur Therapie pathologischer Veränderungen der Funktionsstruktur
tieferer Hautschichten höhere Konzentrationen benötigt und angestrebt.
In der praktischen Dermatologie und Kosmetik ist Harnstoff in der Therapie trockener
Hautzustände, als keratoplastische Substanz, Penetrationspromotor und bei der Pflegetherapie
chronisch entzündlicher Dermatosen etabliert [30]. Hierbei ist nicht die topisch applizierte Harnstoffkonzentration an sich, sondern
die tatsächlich liberierte und in die Epidermis penetrierte Konzentration sowie das
Konzentrations-Zeit-Profil wesentlich [32].
Die galenische Güte von harnstoffhaltigen Externa ist bekanntermaßen sehr unterschiedlich.
Deshalb ist die Unterteilung der Präparationen nach dem Harnstoffgehalt (ca. 3 - 15
%) nicht mit der klinischen Wirksamkeit identisch. Aus diesem Grund werden Präparationen
mit einem hohen Harnstoffgehalt (ca. > 5 %) eine bessere therapeutische Effektivität
zuerkannt. Gleichwohl können diese auch verstärkt Nebenwirkungen hervorrufen [32]. Da Harnstoff keine sensibilisierende Potenz besitzt, sind insbesondere auf entzündlicher,
mit Erosionen oder Rhagaden behafteter Haut zu beobachtende Reizungen und brennende
Schmerzen von praktischer Bedeutung. Dieser irritative Reizeffekt schränkt den klinischen
Einsatz von Harnstoff ein.
Arginin im NO-Stoffwechsel
Arginin im NO-Stoffwechsel
Einer der wohl wichtigsten Regulationsfaktoren des kardiovaskulären Systems stellt
neben der vegetativen Innervation das Gas Stickstoffmonoxid (NO) dar [28]. Dies gilt für die Makro- und Mikrozirkulation in gleicher Weise. NO wird durch
das Enzym NO-Synthase (NOS) aus L-Arginin gebildet und rasch nach Oxygenierung zu
Nitraten und Nitriten metabolisiert und damit inaktiviert [16].
Es sind drei Isoformen dieses Enzyms bekannt. Neben zwei membrangebundenen, Kalzium-
und Calmodulin-abhängigen Formen (cNOS oder niNOS) unterscheidet man eine zytosolische,
kalziumunabhängige induzierbare Form (iNOS). Die nicht-induzierbaren Isoformen konnten
in neuronalen (nNOS - im Gehirn auch bNOS) und endothelialen Zellen (eNOS) sowie Keratinozyten
und die induzierbare Form (iNOS) z. B. in Makrophagen nachgewiesen werden. Alle Isoformen
können einzeln oder zusammenfassend durch universal NOS(uNOS)-Antikörper nachgewiesen
werden. Für die Regulation der Enzymaktivität der cNOS ist der intrazelluläre Kalziumgehalt
von entscheidender Bedeutung. Die iNOS hingegen enthält zwar das kalziumbindende Protein
Calmodulin, wird aber nicht kalziumabhängig gesteuert. Eine erhöhte Aktivität ist
hier nur durch Proteinsynthese möglich. Alle NOS-Isoformen sind spezifisch für L-Isomere
des Arginins. Sie liegen sämtlich in partikulärer (membrangebundener) und löslicher
(zytosolischer) Form vor [7]
[16].
Die katalysierte Reaktion der NOS von L-Arginin zu L-Citrullin und NO läuft in zwei
Schritten ab. Beide Teilreaktionen sind NADPH-, Kalzium- bzw. Calmodulin- (außer iNOS)
und Tetrahydrobiopterin(BH4)-abhängig. Im Zwischenschritt wird aus L-Arginin unter der Bildung von Wasser und
NADP+ N-hydroxy-L-Arginin gebildet (Abb. [4]). Die Produktstöchiometrie von L-Citrullin und NO beträgt 1 : 1 [19].
Abb. 4 Schematische Darstellung der durch die NO-Synthese katalysierten zweiphasigen Umsetzung
von L-Arginin zu L-Citrullin und NO (nach [16]).
Als Kofaktoren fungieren für alle Isoformen NADPH, O2, Tetrahydrobiopterin (BH4) und häufig auch FAD und FMN. Die NADPH- und Flavinbindende Domäne von cNOS ist identisch
mit der Cytochrom-P450-Reduktase. Das Molekulargewicht der Monomere der Isoformen
ist unterschiedlich und wird für iNOS mit ca. 130 kDa und für cNOS mit 155 kDa angegeben
[16]. Darüber hinaus lassen sich Unterschiede zwischen dem löslichen und partikulären
Typ nachweisen [7].
Stickstoffmonoxid stellt ein sehr triviales Molekül dar. Es besteht aus einem einfachen
Sauerstoffatom, welches an ein Stickstoffatom gebunden ist. Für physiologische Regulationsvorgänge
haben sich 3 biochemische Reaktionen von gelöstem NO als grundlegend erwiesen [7]
[16]
[19].
Die erste und wahrscheinlich für den In-vivo-NO-Verbrauch wichtigste Reaktion ist
die irreversible und schnelle Bildung von Nitrat durch Bindung an Oxyhämoglobin (Hb)
oder Oxymyoglobin.
Hb-Fe2+ - O2 + ·NO → Hb-Fe2+ OONO → Hb-Fe2+ + NO3
- (Reaktion 1)
Die zweite Reaktion ist die Bindung von NO an eisenhaltiges Häm der Guanylat-Cyclase
oder anderer Proteine. Dies ist für die Aktivierung von Signaltransduktionswegen von
Bedeutung.
Häm-Fe2+ + ·NO → Häm-Fe2+ - NO (Reaktion 2)
Die dritte Reaktion ist die Bildung von Peroxynitrit-Anionen (ONOO -). Dabei reagieren Superoxide (O2·) irreversibel mit NO.
·NO + ·O-O:- → ONOO - (Reaktion 3)
Alle aufgeführten Reaktionen bedingen zusammen wesentlich die kurze Halbwertszeit
von NO. Diese bemerkenswerte Reaktionsvielfalt beruht auf einem unpaaren Elektron
im so genannten „highest occupied molecular orbital (HOMO)”, also auf der äußersten
Elektronenhülle (Abb. [5]). Sauerstoff besitzt 6, Stickstoff dagegen nur 5 Elektronen. Somit besitzt NO insgesamt
11 Elektronen. Da auf jeder Elektronenhülle lediglich 2 Elektronen gehalten werden
können, befindet sich somit ein Elektron alleine auf der äußeren Hülle [7].
Als kleinmolekulares hydrophobes Gas durchdringt NO Zellmembranen leichter als molekularer
Sauerstoff oder Kohlendioxid und benötigt keinen Rezeptor oder transmembranösen Transportmechanismus
[16]. Somit verteilt sich NO isotrop im umgebenden Gewebe. Auch der Diffusionskoeffizient
(bei 37 °C) von NO in Wasser ist größer als der von O2, CO2 oder CO. Durch die hohe Reaktionsbereitschaft hat NO eine äußerst kurze Halbwertszeit
und die biologische Wirkung ist lokal begrenzt [3]. Dabei nimmt die Konzentration und damit die biologische Wirkung von NO durch Reaktion
mit Sauerstoff radiär um die Bildungsstelle ab. Durch das unpaare Elektron bindet
NO mit hoher Affinität an metallische Cofaktoren von Enzymen. Die Aktivierung der
Guanylat-Cyclase führt zum Anstieg des intrazellulären Messengers cGMP [7]. Dieser bewirkt eine Inaktivierung der kontraktilen Elemente in glatten Muskelzellen
der Gefäßwände und führt damit zur Vasodilatation. Darüber hinaus wird eine nitrinerge
Neurotransmission in peripheren glatten Muskelzellen, eine Hemmung der Blutgerinnung
(Thrombozytenaggregation und -adhäsion) sowie eine Modulation der synaptischen Plastizität
im ZNS vermittelt [7]
[16]
[19]. Intrazelluläres cGMP wird durch die lösliche Isoform der Guanylatcyclase (sGC)
katalysiert und hat Effekte auf die Transkription, die mRNA-Translation und tritt
direkt mit der DNA in Wechselwirkungen [3]
[7]. Eine posttranslationale Modifikation von Proteinen sowie die Hemmung Fe-abhängiger
Enzyme sind insbesondere in Hinblick auf den NO-Stoffwechsel von Bedeutung. Durch
das Schlüsselenzym GTP-cyclohydrolase I wird GTP zu Tetrahydrobiopterin (BH4) umgewandelt, welches einen essenziellen Cofaktor für alle Isoformen der NOS darstellt
[16].
In Keratinozyten ist cNOS und iNOS als Protein nachgewiesen worden [3]
[28]. Über die biologische Bedeutung dieses Enzyms innerhalb des Epithels kann bisher
nur spekuliert werden. Die Bedeutung von NO als Radikalfänger und bei der immunologischen
Signaltransduktion steht hierbei im Mittelpunkt des Interesses [3]. Nach topischer Applikation von L-Arginin-haltigen Präparationen konnten wir einen
vasodilatativen Effekt nachweisen [27]
[28]. Wir machen dafür eine Aktivitätssteigerung der NOS-Isoformen verantwortlich.
Von Bedeutung ist insbesondere die Funktion von NO bei der Auslösung und Unterhaltung
von Entzündungsabläufen. Durch Initiation der Expression von Adhäsionsmolekülen an
mikrohämovaskulären Endothelzellen [19], Verstärkung der Zytokinexpression aktivierter Lymphozyten, Aktivierung und Proliferationsstimulation
von Lymphozyten, Makrophagen, Eosinophilen und Mastzellen trägt NO wesentlich zu physiologischen
und pathophysiologischen Entzündungsprozessen bei. Des Weiteren ist NO für eine Maximierung
der durch natürliche Killerzellen (NK) bzw. durch Lymphozyten aktivierte Killerzellen
(LAK) bedingte Zytotoxizität verantwortlich und hat damit Einfluss auf tumor- sowie
transplantationsimmunologische Entzündungsreaktionen. Unabhängig davon reguliert NO
die Freisetzung einer Reihe von Hormonen. Insbesondere betrifft dies direkt oder indirekt
Hormone mit Wirkung auf das kardiovaskuläre System. Durch die hohe Reaktivität des
NO-Moleküls wird auch die antioxidative Wirkung erklärt. Hierbei kommt es vor allem
zur Reaktion mit Superoxiden zu Peroxinitriden [16]
[19]. Superoxide sind insbesondere bei Entzündungs- und immunologischen Abläufen, sowie
im Rahmen der Abwehr von Erregern von Bedeutung [19]. Es ist weiterhin bekannt, dass NO sehr intensiv an deoxygeniertes Hämoglobin unter
Bildung von Nitroso-Hämoglobin und an oxygeniertes Hämoglobin unter Bildung von Meth-Hämoglobin
bindet [7].
Transmembranöser Transport von L-Arginin
Transmembranöser Transport von L-Arginin
L-Arginin wird vorzugsweise durch das Y+-System Carrier-vermittelt durch Keratinozyten aufgenommen [25]. Das Y+-System ist ein Natrium-, Kalzium- und pH-unabhängiger, löslicher, kationischer Aminosäure-Transporter,
der neben L-Arginin auch L-Lysin und L-Ornithin transportiert. Er wird mindestens
durch 3 Gene (Cat1, Cat2, Cat3) kodiert und ist pH-unabhängig. Der L-Arginin-Transport
ist stereospezifisch und wird durch einen Überschuss an kationischen Arginin-Analoga
sowie durch die eNOS-Blocker L-NMMA und L-NIO gehemmt. Die Aktivität des Y+-Systems wird wahrscheinlich spannungsabhängig über Hyperpolarisation der Zellmembran
gesteuert [25]. Die Öffnung Kalzium-abhängiger Kaliumkanäle führt zu einer Hyperpolarisation und
zum verstärkten Influx von L-Arginin über das Y+-System (Abb. [6]). Darüber hinaus wird durch erhöhte Glukose-, Insulin- oder PGI2-Konzentrationen [25] sowie Interleukin-1 (IL-1)- und Tumornekrosefaktor (TNF)-vermittelte Endotoxinfreisetzung
die Aktivität des Y+-Systems gesteigert und durch Lysophosphatidylcholin, kationische Proteine oder Hypoxie
gesenkt. Die Aktivität des Y+-Systems ist unter Normbedingungen sehr niedrig. Für Hepatozyten wird die intrazelluläre
L-Argininkonzentration mit 5 µmol/l und die Plasmakonzentration mit 50 - 100 µmol/l
angegeben.
Abb. 6 Transport von L-Arginin in den Keratinozyten durch das Y+-System.
Über die Regulation der Expression des Y+-Systems an Keratinozyten liegen bisher keine Untersuchungen vor. Aus In-vitro-Versuchen
an Hepatozyten der Ratte (FTO2B) [17] sowie humanen vascular smooth muscle cells (VSMC) und In-vivo-Untersuchungen an
Ratten [17] ist bekannt, dass die Gene Cat-1 und Cat-2 von Bedeutung sind, deren Expression
in unterschiedlicher Weise transkriptional und post-transkriptional reguliert werden.
Die Stimulation durch Lipopolysaccharide (LPS) bewirkt bei Ratten eine Expression
von CAT-1 mRNA und CAT-2B mRNA in Zellen von Lunge, Herz und Nieren. LPS-unabhängig
wird CAT-2A mRNA in der Leber exprimiert. Unter physiologischen Bedingungen ist die
CAT-1 mRNA-Expression in Leberzellen weitgehend stabil. Hingegen führen die Stimulation
des Zellwachstums, erhöhte Insulinspiegel oder Glukokortikoidapplikation zu einer
Induktion der mRNA-Expression von CAT-1 [17]. Die molekularen Mechanismen der Regulation der CAT-1 und CAT-2 Expression sind
allerdings gänzlich unbekannt.
Neben diesem spezifischen Transportsystem sind unspezifische Aminosäure-Transporter
bekannt, die wahrscheinlich unter physiologischen Bedingungen für L-Arginin keine
große Relevanz besitzen. In diesem Zusammenhang sind das A- (neutraler Aminosäure-Transporter),
ASC- und B0+-System [7], welche einen Na2+-Gradienten an der Plasmamembran benötigen, und das L-System, welches Na2+-unabhängig ist, nennenswert. Bogle et al. [2] vermuten, dass bei einer erhöhten extrazellulären L-Argininkonzentration neben dem
Y+-System auch diese unspezifischen transmembranösen Aminosäuretransporter L-Arginin
in die Zelle transportieren.
Toxikologische Eigenschaften von L-Arginin
Toxikologische Eigenschaften von L-Arginin
L-Arginin kann aus zytotoxikologischer Sicht als unbedenklich eingeschätzt werden
[21]. Wir konnten einen proliferationshemmenden Effekt erst bei Konzentrationen von ≥
50 mmol/l L-Arginin darstellen und zellmorphologisch nachweisen. In darunterliegenden
Konzentrationen steigerte L-Arginin sogar die Thymidineinbaurate deutlich [29]. Dies unterstreicht die wichtige Bedeutung von L-Arginin für die Proteinbiosynthese
und die komplexe Einbindung in den Zellstoffwechsel. Mendez et al. [20] belegten diese Bedeutung bereits an Rattenembryonen. Durch kompetitive Blockade
des transzytomembranösen Transportsystems (Y+) des L-Arginins durch NG-monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) [7] wurden schwere Retardierungen der Embryonen beobachtet. Zu erklären ist dieser Effekt
durch den Einfluss von L-Arginin auf die Polyaminsynthese. Polyamine (z. B. Spermidin,
Spermin) sind niedermolekulare Verbindungen, die nahezu ubiquitär in humanen Zellen
vorkommen und einen stimulierenden und steuernden Effekt auf den Zellzyklus und damit
auf die Proliferation und Differenzierung haben. Darüber hinaus beeinflusst L-Arginin
die Synthese von Pyrimidinnukleotiden, die als essenzielle Bausteine der DNA- und
RNA-Synthese fungieren.
Dass L-Arginin in hohen Konzentrationen direkt oder indirekt auch kanzerogene Wirkung
besitzen kann, steht nicht außer Zweifel, erscheint jedoch eher unwahrscheinlich.
Chamorro et al. [5] berichteten bei Blockade der Arginase (A2) mit (+)- S-2-Amino-6-Iodoacetamidohexansäure
(2-AIHA) über die Ausbildung von Neoplasien. Ob dieser Sachverhalt mit dem intrazellulären
L-Argininüberschuss in unmittelbarem Zusammenhang steht, ist unbekannt. Allerdings
wurde bei Patienten mit einem seltenen hereditären AI-Defizit und einer dadurch bedingten
Hyperargininämie eine Häufung von Tumoren nicht beobachtet.
Durch flowzytometrische Untersuchungen an Keratinozyten mit Propidiumjod und Annexin-V
konnten wir zeigen, dass L-Arginin erst ab ≥ 50 mmol/l apoptoseinduzierend wirkt [29]. Die Applikationszeit des L-Arginins scheint allerdings nur wenig ausschlaggebend
für diese Wirkung zu sein. Dies belegen auch eigene flowzytometrische Daten mit dem
APO2.7-Antikörper [27]
[29]. Demnach wird unabhängig von der Kontaktzeit eine Apoptose konzentrationsabhängig
induziert. Dabei handelt es sich um sehr hohe unphysiologische Konzentrationen, deren
Relevanz auch unter therapeutischen Gesichtspunkten als sehr fragwürdig einzustufen
ist.
Durch Bestimmung der LDH-Aktivität in Keratinozytenkulturen wurde nachgewiesen, dass
nur lange Inkubationszeiten und hohe Konzentrationen von L-Arginin einen nekrotischen
Effekt bedingen [29]. Die Annahme der zytotoxikologischen Unbedenklichkeit von L-Arginin wird somit durch
eigene Untersuchungen bestätigt.
Topische Anwendung von Arginin
Topische Anwendung von Arginin
Die Möglichkeiten einer topischen Anwendung von argininhaltigen Präparationen sind
vielfältig. Grundsätzlich muss das therapeutische bzw. pflegetherapeutische Ziel unter
Beachtung der genannten biochemischen Reaktionen und den Zellen in den jeweiligen
Kompartimenten des Hautorgans ausgerichtet werden.
Die topische Applikation von L-Arginin und ggf. auch in Kombination mit dem Cofaktor
der Arginase Mangan (in Form von Manganchorid) stehen dabei im Vordergrund des Interesses.
Eigene Untersuchungen an gesunden Probanden haben gezeigt, dass die zweimal tägliche
topische Applikation einer 10 %igen L-Argininhaltigen amphiphilen Creme eine Senkung
des transepidermalen Wasserverlustes (TEWL) und eine Steigerung der Hydratation der
Hornschicht bewirkt [27]. Dieser Effekt ist im Ausmaß etwas geringer als bei einer 10 %igen harnstoffhaltigen
Präparation bei Verwendung des gleichen Vehikelsystems. Wir führen diese Wirkung hauptsächlich
auf eine Aktivierung der keratinozytären Arginase zurück. Darüber hinaus besitzt L-Arginin
eine solubilisierende Wirkung auf Proteine und trägt dadurch zusätzlich zur Steigerung
der Wasserbindungskapazität der Hornschicht bei.
In einer plazebokontrollierten Fallstudie an Patienten mit einer atopischen Disposition
konnten wir feststellen, dass die nach dem Auftragen einer harnstoffhaltigen Präparation
auf läsionaler Haut auftretende Reizwirkung bei L-Arginin nicht zu beobachten ist
[27]. Hinsichtlich des Pflegeeffektes der L-Arginin-haltigen Präparation konnten wir
im Vergleich zur harnstoffhaltigen Präparation keine Unterschiede feststellen. Aus
kosmetischer und pflegetherapeutischer Sicht bietet sich somit eine Vielzahl von Einsatzmöglichkeiten.
Die Nutzung von L-Arginin als Substrat der NOS-Isoformen in Keratinozyten und kutanen
mikrovaskulären Endothelzellen stellt ein weiteres potenzielles Anwendungsgebiet dar.
Dabei stehen vor allem die immunmodulatorischen und antimikrobiellen Eigenschaften
von NO im Mittelpunkt des Interesses. Einzelfallbeobachtungen lassen vermuten, dass
eine regelmäßige topische Anwendung von L-Arginin-haltigen Präparationen bei Patienten
mit trockener Haut die Keimdichte auf der Haut reduziert und bakterielle (Staph. aureus)
und virale (Molluscum contagiosum-Viren) Superinfektionen durch Minderung der Keimadhärenz
und immunmodulatorische Einflüsse erschwert. Weiterhin bewirkt die vermehrte Expression
von NO eine Verstärkung der UV-induzierten Zytotoxizität. Durch Aktivierung von NK-
und LAK-Zellen ist eine Suppression der malignen Transformation von Zellen grundsätzlich
möglich.
Ob diese Wirkoptionen praktische Relevanz besitzen, muss in Studien nach GCP-Richtlinien
belegt werden. Die bisher vorliegenden Daten zur topischen Anwendung von Arginin sind
aber aus kosmetischer und pflegetherapeutischer Sicht vielversprechend.
Abb. 2 Schematische Darstellung des keratinozytären L-Arginin-Stoffwechsels (nach [11]).
Abb. 3 Arginase-Reaktion (nach [11]).
Abb. 5 Schematische Darstellung der hohen chemischen Instabilität von NO (nach [16]).
