Sind die Methoden schon praxisreif?

Das humane Genom besitzt nach derzeitigem Kenntnisstand zwischen 30000- 40000 Gene und somit weniger als ursprünglich angenommen [2] [5]. Seine Komplexität resultiert jedoch nicht allein aus der Zahl der Gene, sondern aus der Kombination verschiedenster Regulations- und Kontrollmechanismen, die auf der Ebene der Transkription, der mRNA-Prozessierung, der Translation und der Proteinprozessierung ansetzen. Um diese Komplexität bei der Steuerung physiologischer oder pathophysiologischer Prozesse in Geweben oder Zellen adäquat zu erfassen, bedarf es biotechnologischer Hochdurchsatzmethoden wie der DNA-Chip/Array-Technologie.

So erlaubt es diese Technologie, die Aktivität einer Vielzahl von Genen simultan in einem einzelnen Untersuchungsschritt zu bestimmen. Nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für die molekulare und klinische Medizin - insbesondere auf dem Gebiet der Onkologie -, werden diese Analysen wertvolle Erkenntnisse liefern.

Technologischer Hintergrund

Das Prinzip der DNA-Chip/Array-Analyse beruht ähnlich wie das der „Northern-” oder „Southern-Blot”-Analysen auf der Eigenschaft von Nukleinsäuren, mit Komplementärsträngen passender Sequenz sehr spezifisch stabile Doppelstränge auszubilden. Für die Herstellung der Arrays werden mithilfe von Robotersystemen kurze Sequenzabschnitte für jedes zu untersuchende Gen in hoher Dichte und nach präzisen Mustern auf festen Oberflächen immobilisiert. Als Trägermaterialien dienen in der Regel speziell beschichtete Glasobjektträger („DNA-Chips” im engeren Sinne) oder Nylonmembranen, seltener Kunststoffoberflächen.

Die Genfragmente werden entweder in Mikrotiterplatten vorgelegt und von Präzisions-Robotern auf das Trägermaterial übertragen („Spotting”; [Abb. 1]) oder in Form von kurzen Oligonukleotiden auf chemischem Wege direkt auf dem Träger synthetisiert. Das Ergebnis sind regelmäßige Anordnungen (so genannte „Arrays”) von immobilisierten ungepaarten Genfragmenten, die im Falle von Glas-Chips eine Dichte von bis zu 10000 Genen pro cm2 erreichen können.

Für die als Expressionsprofil-Analyse bezeichnete Untersuchung von Zellen oder Geweben wird der gesamte mRNA-Bestand der Probe präpariert, mit Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Isotopen markiert und in einem als Hybridisierung bezeichneten Prozess mit dem Array inkubiert. Bei der Hybridisierung bilden die markierten Nukleinsäuremoleküle mit ihren auf dem Array immobilisierten Gegenstücken stabile Doppelstränge aus. Sie können mithilfe eines Fluoreszenz- oder Radioaktivitäts-Scanners detektiert werden.

Im Ergebnis erhält man für jedes auf dem Array repräsentierte Gen ein Signal, dessen Intensität proportional zu der in der analysierten Probe vorhandenen mRNA-Menge für dieses Gen ist. Die Expressionsprofil-Analyse liefert also ein Maß für die transkriptionelle Aktivität der auf dem Array repräsentierten Gene und damit in erster Näherung ein Maß für die biologische Aktivität der zugehörigen Proteine.

Suche nach Zielgenen

Eine konzeptionell sehr nahe liegende Einsatzmöglichkeit für die Array-Technologie in der Onkologie besteht in der Suche nach einzelnen Zielgenen für neue Ansätze in der Diagnostik und Therapie von Tumoren. Aus der Vielzahl von Genen, die in Expressionsprofil-Analysen parallel untersucht werden können, lassen sich mit einfachen statistischen Verfahren sehr schnell Gene identifizieren, die überwiegend oder sogar ausschließlich in Tumorgeweben, nicht aber in Normalgeweben aktiviert sind.

Aus diagnostischen Gesichtspunkten sind zum Beispiel onkofötale Gene von besonderem Interesse. Ein Beispiel ist das in unserer eigenen Arbeitsgruppe mithilfe von Expressionsprofil-Analysen isolierte KOC-Gen, das für ein neuartiges RNA-bindendes Protein kodiert [4]. In ersten klinischen Studien mit Material aus Feinnadelpunktionen und Sekreten konnten wir zeigen, dass PCR-basierte (PCR = „polymerase chain reaction”) diagnostische Tests zum Nachweis der Aktivität dieses Gens mit einer Spezifität von etwa 91 % und einer Sensitivität von ungefähr 97 % maligne Zellen im Punktionsmaterial detektieren. Besonders bei zytologisch nicht eindeutigen Befunden kann dies die Diagnosestellung entscheidend verbessern.

Therapeutische Zielgene müssen zusätzlich zur tumorspezifischen Expression Angriffspunkte für potenzielle Interventionsstrategien bieten. Anhand von Expressionsprofil-Analysen des Pankreaskarzinoms konnten wir kürzlich belegen, dass das Gen für das „Tight-Junction”-Protein Claudin-4 im Pankreaskarzinom stark überexprimiert wird. Im normalen Pankreas ist eine Aktivität dagegen nicht nachweisbar. Das normalerweise im Darmepithel lokalisierte Claudin-4-Protein dient neben seiner physiologischen Funktion auch als Rezeptor für das zytotoxische Clostridium-perfringens-Enterotoxin (CPE), dem Auslöser von Reisediarrhöen.

Im Tierversuch mit subkutan implantierten Claudin-4-exprimierenden Pankreastumoren in immundefizienten Mäusen war zu beobachten, dass die intratumorale CPE-Injektion zur effizienten Lyse der Tumorzellen und zu einer deutlichen Verkleinerung der Tumore führt. Claudin-4-negatives Gewebe dagegen wird nicht geschädigt ([Abb. 2]; [3]). Damit ist Claudin-4 eines der ersten therapeutischen Zielgene, das über Expressionsprofil-Analysen identifiziert wurde.

Eine Vielzahl wertvoller Informationen

Die Möglichkeiten der Array-Technologie gehen jedoch weit über die Anwendung als bloßes Kandidatengen-Screening hinaus. In der Analyse der enormen Datenmengen, die in Array-Experimenten typischerweise erzeugt werden, können auch komplexe Zusammenhänge sichtbar gemacht werden. Mit konventionellen Verfahren lässt sich diese Aufgabe allerdings nicht bewältigen, sodass in zunehmenden Maße Verfahren zur Mustererkennung und Datenklassifikation aus der Informatik zum Einsatz kommen.

Im Bereich der Onkologie eignen sich solche komplexen bioinformatischen Verfahren zur Expressionsprofil-Analyse vor allem in der molekularen Klassifizierung von Tumoren. Aus der Analyse von Biopsaten oder chirurgischen Resektaten werden typische Genexpressionsmuster extrahiert, anhand derer sich die Proben bekannten Subtypen von Tumoren zuordnen lassen („class prediction”). Zusätzlich können diese Muster in Verbindung mit klinischen Patientendaten zur Entdeckung neuer, bislang diagnostisch nicht differenzierbarer Tumor-Subtypen mit prognostisch oder therapeutisch relevanten Eigenschaften führen („class discovery”).

Klassifizierung von Tumoren

Der routinemäßige Einsatz von genomweiten DNA-Chips/Mikroarrays ist jedoch - sowohl analytisch als auch finanziell - sehr aufwändig. Daher ist man bestrebt, durch eine Vorauswahl relevanter Gene spezialisierte „Diagnose-Chips” zu entwickeln, die in der Analyse klinischer Tumorbiopsate die Aufgaben der „class prediction” und „class discovery” erfüllen können. Abhängig von der Auswahl der auf dem Array repräsentierten Gene lässt sich auf diese Weise prinzipiell bestimmen, von welchem Gewebe oder Zelltyp ein Tumor abstammt. So können Primärtumore von Metastasen unterschieden bzw. die ungefähre Lokalisation eines noch nicht identifizierten Primärtumors vorhergesagt werden.

Relevanz gewinnt diese Fragestellung vor allem vor dem Hintergrund, dass mit herkömmlichen diagnostischen Methoden 15-20 % aller Raumforderungen in der Leber (das entspricht etwa 3 % der insgesamt diagnostizierten Karzinome) als „cancers of unknown primary” (CUP-Syndrom) klassifiziert werden, die mangels spezifischer Behandlungsstrategien mit einer sehr ungünstigen Prognose einhergehen.

Auch die differenzialdiagnostisch oftmals schwierige Abgrenzung von malignen gegenüber benignen oder entzündlichen Prozessen lässt sich mit einer geeigneten Genauswahl bewerkstelligen. In diesem Zusammenhang konnten wir in ersten klinischen Studien mit einem in unserer eigenen Arbeitsgruppe entwickelten 500-Gene-Array zur differenziellen Diagnose von Tumoren des Gastrointestinaltrakts nachweisen, dass dieser Array zuverlässig zwischen malignen und entzündlichen Raumforderungen im Pankreas differenziert ([Abb. 3a] und [3b]).

Individualisierung von Therapieoptionen

Über die rein diagnostische Anwendung hinaus liegt jedoch ein großes Potenzial dieser Technologie in der Konzipierung spezifischer, auf jeden Patienten individuell abgestimmter Therapien. Mit den Methoden der Array-Technologie lässt sich in einem einzelnen Detektionsschritt simultan eine Vielzahl verschiedener prognostischer Marker erfassen, die Informationen über den zu erwartenden Verlauf der Erkrankung liefern können.

Zum Beispiel weist eine Überexpression von Wachstumsfaktoren oder ihren Rezeptoren bzw. die Ausbildung von so genannten „autocrine loops” auf ein ausgeprägtes proliferatives Potenzial des Tumors hin, während eine Deregulation von Matrix-Metalloproteinasen und ihren Inhibitoren Rückschlüsse auf die Neigung zur Metastasierung zulassen. Gleichzeitig lässt sich das stetig zunehmende Wissen über die an der Resistenzbildung gegen bestimmte Chemotherapeutika beteiligten Gene dazu nutzen, um im Zusammenspiel mit weiteren klinischen Parametern bereits im Vorfeld einer Therapie die jeweils Erfolg versprechendste Kombination verschiedener therapeutischer Verfahren und Nachsorgemaßnahmen zu ermitteln.

Geringe Mengen von Biopsiematerial reichen aus

Die größte Herausforderung für die routinemäßige klinische Anwendung der Array-Technologie liegt in der häufig sehr begrenzten Menge des zur Verfügung stehenden Untersuchungsmaterials. Für die Studien mit unserem oben beschriebenen Diagnose-Chip setzen wir ein so genanntes lineares Amplifikations-Verfahren ein. Dieses erlaubt es uns, aus geringen Materialmengen - wie sie zum Beispiel aus Feinnadelpunktionen gewonnen werden - zuverlässige Expressionsprofile zu erstellen. Unsere Ergebnisse zeigen am Beispiel des Pankreaskarzinoms, dass sonografisch oder endosonografisch gesteuerte Feinnadelbiopsien mit anschließender Expressionsprofil-Analyse eine präzise Diagnose solider Tumore erlauben ([Abb. 3a] und [3b]).

Ein besonders interessanter Ansatz besteht in der Isolierung zirkulierender Tumorzellen aus peripherem Blut. Dies ist eine äußerst attraktive Möglichkeit, aus einfach zu gewinnenden Blutproben wertvolle Informationen über das Vorhandensein und die Eigenschaften eines Tumors zu generieren. Jüngst publizierte Ergebnisse von Klein und Mitarbeitern [1] zeigen, dass es mithilfe spezieller Amplifikationsverfahren möglich ist, sogar aus einzelnen disseminierten Tumorzellen aus peripherem Blut und/oder Knochenmark sowohl Genom- als auch Expressionsprofil-Analysen durchzuführen - die bis zu einem gewissen Grad Rückschlüsse auf den zugrunde liegenden Tumor zulassen.

Insgesamt hat die DNA-Chip/Mikroarray-Technologie also ein enormes Potenzial für die Entwicklung neuer diagnostischer, prognostischer und therapeutischer Verfahren in der Onkologie. Aus der onkologischen Grundlagenforschung ist sie bereits heute kaum mehr wegzudenken. Auch wenn DNA-Arrays bis auf wenige Ausnahmen noch ein gutes Stück von der Anwendung der klinischen Routine entfernt sind, ist zu erwarten, dass diese Technologie in der nahen Zukunft zum diagnostischen Standardrepertoire des Onkologen gehören wird.

Abb 1. Genfragmente in Mikrotiterplatten (a), Roboter-Druckkopf mit Präzisionsnadeln zur Übertragung der Genfragmente (b), puffergetränkte Nylonmembranen zur Immobilisierung der Genfragmente (c) (zentrale Chip-Facility des Universitätsklinikums Ulm)

Abb 2. Zu sehen sind die Pankreastumore nach der Injektion von normaler Saline (a) und C.-perfringens-Enterotoxin (b). CPE führt zur Tumorzelllyse und zu einer deutlichen Verkleinerung des Tumors (Pfeile)

Abb 3a. Überblenddarstellung von Beispielhybridisierungen mit chronischer Pankreatitis- und Pankreaskarzinom-Proben auf dem „Diagnose-Chip”. Gene, die in der chronischen Pankreatitis stärker exprimiert sind, erscheinen grün, karzinomspezifische Gene rot und gleichmäßig exprimierte Gene gelb

Abb 3b. Ausschnitt aus der „Cluster-Analyse” einer Serie von Expressionsprofil-Analysen von Pankreasgeweben mit dem „Diagnose-Chip”. Die farbigen Zellen repräsentieren die Expressionsstärke der Gene (Kennzeichnung nach Position auf dem Array, z.B. „I01a”) in den verschiedenen Geweben. Grün bedeutet niedrige, rot hohe und schwarz mittlere Expressionsstärke. Pankreaskarzinom- und Pankreatitis-Proben lassen sich eindeutig voneinander differenzieren. Die mit Sternchen gekennzeichneten Proben stammen aus Feinnadelbiopsien von Pankreaskarzinomen

Literatur

• 1 Klein CA, Seidl S, Petat-Dutter K. et al. . Combined transcriptome and genome analysis of single micrometastatic cells.  Nat Biotechnol. 2002;  20 387-392
• 2 International Human Sequencing Consortium. . Initial sequencing and analysis of the human genome.  Nature. 2001;  409 860-921
• 3 Michl P, Buchholz M, Rolke M. et al. . Claudin-4: a new target for pancreatic cancer treatment using Clostridium perfringens enterotoxin.  Gastroenterology. 2001;  121 678-684
• 4 Mueller-Pillasch F, Lacher U, Wallrapp C. et al. . Cloning of a gene highly overexpressed in cancer coding for a novel KH-domain containing protein.  Oncogene. 1997;  14 2729-2733
• 5 Venter JC, Adams MD, Myers EW. et al. . The sequence of the human genome.  Science. 2001;  291 1304-1351

Glossar Blotting Untersuchungsverfahren, bei dem das Material nach der Auftrennung (z.B. mittels Elektrophorese) auf eine Membran aus Nylon, Nitrozellulose oder Ähnlichem übertragen wird. Die Visualisierung erfolgt zum Beispiel über die Bindung fluoreszierender oder radioaktiv markierter Gensonden Expressionsprofil Gesamtheit aller in einem Gewebe oder einer Zelle als mRNA vorliegenden aktiven bzw. exprimierten Gene Genom Gesamtheit der genetischen Elemente (Gene) eines Organismus Genexpression Aktivierung eines Gens durch Übersetzung der in der DNA gespeicherten genetischen Information in mRNA-Kopien und gegebenenfalls Proteine Northern Blot Blotting-Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren onkofötale Gene Gene, die im gesunden Organismus ausschließlich in bestimmten Phasen der Embryonalentwicklung aktiv sind, jedoch im Rahmen der Tumorgenese in neoplastischen Zellen reaktiviert werden Southern Blot Blotting-Verfahren zum Nachweis von Desoxyribonukleinsäure-Fragmenten Transkription Erstellung von mRNA-Kopien eines Gens; erster Schritt zur ‡Genexpression Translation Übersetzung der mRNA-Sequenz in Proteine

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