Differenzierungsverhalten humaner adulter arthrotischer Chondrozyten unter 2 D- und 3 D-Kultivierungsbedingungen in einem Kollagen-I-Gel

Zusammenfassung

Ziel: Ziel der Studie war es, den Einfluss von Kulturbedingungen auf die Differenzierung humaner Chondrozyten in Monolayerkultur (2 D) und in einer 3-dimensionalen Kollagen-I-Matrix hinsichtlich knorpelspezifischer Marker zu untersuchen. Methode: Humane arthrotische Knorpelzellen wurden von neun adulten Spendern (Durchschnittsalter 72,1 Jahre) isoliert, denen eine Knieendoprothese implantiert wurde. Die isolierten Zellsuspensionen wurden geteilt und je ein Anteil im dreidimensionalen Kollagengel (3 D) und in Monolayerkultur (2 D) kultiviert. Mit Hilfe der Real-time-PCR wurde der mRNA-Anteil für Kollagen I und II, Aggrecan und melanoma inhibitory activity (MIA) zu unterschiedlichen Zeitpunkten quantifiziert. Ergebnisse: In der 2 D-Passagierung zeigte sich zwischen P 00 und P 01 ein signifikanter Anstieg der Kollagen-I-Expression (p = 0,009), während die Kollagen-II-Expression signifikant abfiel (p = 0,022). In der 3 D-Kultivierung waren die Messunterschiede für Kollagen I nicht signifikant (p = 0,757), wohingegen es bei der Kollagen-II-Expression zwischen 2 und 4 Wochen zu einem signifikanten Abfall kam (p = 0,001). Schlussfolgerung: Bei zunehmender Passagierung humaner adulter Knorpelzellen älterer Patienten in Monolayer (2 D)-Kulturen kommt es zu einer verminderten Expression von Kollagen II. Bei einer 3 D-Kultivierung wird dieser Abfall verzögert. Die Annahme, eine Knorpelzelldedifferenzierung durch 3 D-Kultivierung aufzuhalten oder rückgängig zu machen, wird durch unsere Studie infrage gestellt. Auf der Basis unserer Ergebnisse empfehlen wir die Verwendung frisch isolierter und somit gering dedifferenzierter Knorpelzellen zur Knorpelzelltransplantation.

Abstract

Aim: The aim of this study was to assess the influence of culture conditions on the differentiation of human chondrocytes expanded in monolayer (2 D) or a three-dimensional (3 D) biodegradable collagen type I matrix, with regard to chondrocyte-specific markers. Method: Human arthrotic chondrocytes were taken from nine adult donors (average age 72.1 years) undergoing knee replacement. The isolated cell suspensions were split and cultivated either in a 3-dimensional collagen gel (3 D) or in a monolayer (2 D). The amounts of mRNA for collagen I and II, aggrecan and melanoma inhibitory activity (MIA) were quantified by means of real-time PCR at different times. Results: The 2 D-passaged cells showed a significant increase of collagen I between P 00 and P 01 (p = 0.009), whereas the expression of collagen II decreased significantly (p = 0.022). There was no significant change for collagen I in 3 D-cultivation, whereas the collagen II expression decreased significantly after 2 to 4 weeks (p = 0.001). Conclusion: Human adult chondrocytes obtained from elderly patients showed a decreased expression of collagen II with increased passaging in the monolayer (2 D). The decrease was delayed in 3 D-cultivation. We thus question the assumption that the dedifferentiation of chondrocytes can be prevented or reversed by 3 D-cultivation. Based on our results, we recommend the use of freshly isolated and therefore sparsely dedifferentiated chondrocytes for transplantation.

Schlüsselwörter

Knorpel - Kollagen I - Kollagen II - Transplantation, Real-time-PCR - Dedifferenzierung

Key words

cartilage - collagen I - collagen II - transplantation, real-time PCR - dedifferentiation

Literatur

• 1 Poole A R, Kojima T, Yasuda T, Mwale F, Kobayashi M, Laverty S. Composition and structure of articular cartilage: a template for tissue repair.  Clin Orthop. 2001;  (391 Suppl) S 26-S 33
• 2 Malinin T, Ouellette E A. Articular cartilage nutrition is mediated by subchondral bone: a long-term autograft study in baboons.  Osteoarthritis Cartilage. 2000;  8 483-491
• 3 Lind M, Vinther M U, Larsen A S, Jensen S K, Kristensen G. [Surgery on articular cartilage: from debridement to tissue engineering].  Ugeskr Laeger. 2005;  167 3763-3767
• 4 Andereya S, Mumme T, Muller-Rath R, Schneider U. Welche Faktoren beeinflussen das Ergebnis der ACT bei Überschreiten der Indikationsgrenzen?.  Z Orthop Ihre Grenzgeb. 2004;  142 651-658
• 5 Peterson L. Articular cartilage injuries treated with autologous chondrocyte transplantation in the human knee.  Acta Orthop Belg. 1996;  62 196-200
• 6 Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.  N Engl J Med. 1994;  331 889-895
• 7 Dell'Accio F, De Bari C, Luyten F P. Molecular markers predictive of the capacity of expanded human articular chondrocytes to form stable cartilage in vivo.  Arthritis Rheum. 2001;  44 1608-1619
• 8 Homicz M R, Schumacher B L, Sah R L, Watson D. Effects of serial expansion of septal chondrocytes on tissue-engineered neocartilage composition.  Otolaryngol Head Neck Surg. 2002;  127 398-408
• 9 Schulze-Tanzil G, de Souza P, Villegas Castrejon H, John T, Merker H J, Scheid A, Shakibaei M. Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in high-density cultures.  Cell Tissue Res. 2002;  308 371-379
• 10 Uchio Y, Ochi M, Matsusaki M, Kurioka H, Katsube K. Human chondrocyte proliferation and matrix synthesis cultured in Atelocollagen gel.  J Biomed Mater Res. 2000;  50 138-143
• 11 Freed L E, Marquis J C, Nohria A, Emmanual J, Mikos A G, Langer R. Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers.  J Biomed Mater Res. 1993;  27 11-23
• 12 Almqvist K F, Wang L, Wang J, Baeten D, Cornelissen M, Verdonk R, Veys E M, Verbruggen G. Culture of chondrocytes in alginate surrounded by fibrin gel: characteristics of the cells over a period of eight weeks.  Ann Rheum Dis. 2001;  60 781-790
• 13 Kaps C, Frauenschuh S, Endres M, Ringe J, Haisch A, Lauber J, Buer J, Krenn V, Haupl T, Burmester G R, Sittinger M. Gene expression profiling of human articular cartilage grafts generated by tissue engineering.  Biomaterials. 2006;  27 3617-3630 ,  Epub 2006 Mar 20
• 14 Yamaoka H, Asato H, Ogasawara T, Nishizawa S, Takahashi T, Nakatsuka T, Koshima I, Nakamura K, Kawaguchi H, Chung U I, Takato T, Hoshi K. Cartilage tissue engineering using human auricular chondrocytes embedded in different hydrogel materials.  J Biomed Mater Res A. 2006;  4 4
• 15 Behrens P, Bosch U, Bruns J, Erggelet C, Esenwein S A, Gaissmaier C, Krackhardt T, Lohnert J, Marlovits S, Meenen N M, Mollenhauer J, Nehrer S, Niethard F U, Noth U, Perka C, Richter W, Schafer D, Schneider U, Steinwachs M, Weise K. Indikations- und Durchführungsempfehlungen der Arbeitsgemeinschaft „Geweberegeneration und Gewebeersatz” zur Autologen Chondrozyten-Transplantation (ACT).  Z Orthop Ihre Grenzgeb. 2004;  142 529-539
• 16 Kuo C K, Li W J, Mauck R L, Tuan R S. Cartilage tissue engineering: its potential and uses.  Curr Opin Rheumatol. 2006;  18 64-73
• 17 Nehrer S, Breinan H A, Ramappa A, Hsu H P, Minas T, Shortkroff S, Sledge C B, Yannas I V, Spector M. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model.  Biomaterials. 1998;  19 2313-2328
• 18 Frenkel S R, Toolan B, Menche D, Pitman M I, Pachence J M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair.  J Bone Joint Surg [Br]. 1997;  79 831-836
• 19 Galois L, Hutasse S, Cortial D, Rousseau C F, Grossin L, Ronziere M C, Herbage D, Freyria A M. Bovine chondrocyte behaviour in three-dimensional type I collagen gel in terms of gel contraction, proliferation and gene expression.  Biomaterials. 2006;  27 79-90
• 20 Russlies M, Ruther P, Koller W, Stomberg P, Behrens P. Biomechanische Eigenschaften von Knorpelersatzgewebe nach verschiedenen Methoden der Knorpeldefektbehandlung beim Schaf.  Z Orthop Ihre Grenzgeb. 2003;  141 465-471
• 21 Freed L E, Hollander A P, Martin I, Barry J R, Langer R, Vunjak-Novakovic G. Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system.  Exp Cell Res. 1998;  240 58-65
• 22 Dounchis J S, Bae W C, Chen A C, Sah R L, Coutts R D, Amiel D. Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid grafts.  Clin Orthop. 2000;  (377) 248-264
• 23 Mooney D J, Organ G, Vacanti J P, Langer R. Design and fabrication of biodegradable polymer devices to engineer tubular tissues.  Cell Transplant. 1994;  3 203-210
• 24 Perka C, Schultz O, Sittinger M, Zippel H. Chondrozytentransplantation in PGLA/Polydioxanon-Vliesen.  Orthopade. 2000;  29 112-119
• 25 Gavenis K, Muller-Rath R, Schmidt-Rohlfing B, Andereya S, Schneider U. In-vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes.  In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2006;  42 159-167
• 26 Gagne T A, Chappell-Afonso K, Johnson J L, McPherson J M, Oldham C A, Tubo R A, Vaccaro C, Vasios G W. Enhanced proliferation and differentiation of human articular chondrocytes when seeded at low cell densities in alginate in vitro.  J Orthop Res. 2000;  18 882-890
• 27 Kawamura S, Wakitani S, Kimura T, Maeda A, Caplan A I, Shino K, Ochi T. Articular cartilage repair. Rabbit experiments with a collagen gel-biomatrix and chondrocytes cultured in it.  Acta Orthop Scand. 1998;  69 56-62
• 28 Nehrer S, Spector M, Minas T. Histologic analysis of tissue after failed cartilage repair procedures.  Clin Orthop. 1999;  (365) 149-162
• 29 Schmidt-Rohlfing B, Schneider U, Thomsen M, Bosserhoff A K. Correlation of a novel matrix protein with the degree of cartilage degradation.  Rheumatol Int. 2002;  22 165-169
• 30 Stove J, Gerlach C, Huch K, Gunther K P, Brenner R, Puhl W, Scharf H P. Gene expression of stromelysin and aggrecan in osteoarthritic cartilage.  Pathobiology. 2001;  69 333-338
• 31 Moretti M, Wendt D, Dickinson S C, Sims T J, Hollander A P, Kelly D J, Prendergast P J, Heberer M, Martin I. Effects of in vitro preculture on in vivo development of human engineered cartilage in an ectopic model.  Tissue Eng. 2005;  11 1421-1428
• 32 Tallheden T, van der Lee J, Brantsing C, Mansson J E, Sjogren-Jansson E, Lindahl A. Human serum for culture of articular chondrocytes.  Cell Transplant. 2005;  14 469-479