Chiparray-basierte Identifikation von differenziell exprimierten Genen in humanen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) nach in vitro Stromexposition

Zusammenfassung

Fragestellung: Patienten zeigen nach schweren Stromverbrennungen häufig eine progrediente Gewebsschädigung und Thrombose von Blutgefäßen auch fern der Ein- und Austrittsstelle des Stromes. In vorangegangenen Untersuchungen konnten wir in vitro zeigen, dass diese durch eine Freisetzung prothrombotischer Faktoren bedingt ist. Ziel dieser Studie war es, mittels Chiparray-Technologie differenziell exprimierte Gene nach in vitro Stromexposition von HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) zu identifizieren, die für den klinischen Verlauf nach Stromverletzungen bedeutsam sein können. Material und Methoden: Die HUVEC wurden auf eine Kulturschale ausgesät und 25 Stromimpulsen von einer Dauer von jeweils 100 ms bei einer Feldstärke von 60 V/cm ausgesetzt. Eine weitere Schale diente als Kontrolle und unterlag nicht einer Stromzufuhr. Die Konfiguration des PIQOR™ Immunology Array umfasste 1076 cDNAs. Die Analysen wurden mit unbehandelten und den einem elektrischen Feld ausgesetzten Zellen nach sechs und 24 Stunden durchgeführt. Für die Bestimmung der Expressionsprofile wurden 2 µg aRNA aus unbehandelten HUVEC mit Cy3 und die gleiche Menge aRNA aus den beiden einer Stromzufuhr ausgesetzten Proben mit Cy5 markiert. Die Cy5-markierte Probe und die dazugehörende Cy3-markierte Kontrolle wurden gemeinsam auf dem Array hybridisiert. Zur Erstellung der Expressionsprofile wurden für die hybridisierten Arrays zunächst die Signal- und Hintergrundintensitäten für Cy3 und Cy5 bestimmt. Die Hintergrundwerte wurden von den Signalintensitäten subtrahiert und der Quotient aus Cy5/Cy3-Signal berechnet. Die Werte wurden über den Median aller Signalquotienten normiert und anschließend der Mittelwert der Vierfachspots berechnet. Ergebnisse: Von den insgesamt 1076 cDNAs wurden maximal 413 Gene (1 s + s) beziehungsweise 345 Gene (2 s + s) detektiert. Gene, die für das hämostaseologische Gleichgewicht bedeutsam sind (u. a. UPA, UPAR, ECE1, PAFAH1B1, PGT, INOS, ENOS, TPA, ICAM1, VCAM1, PAI1, PAI2, VWF, PTGDR, F3, THBD) zeigten insbesondere nach 24 Stunden veränderte Expressionsprofile, die zu einer späteren Prokoagulabilität führen können. Die Expression proangiogenetischer Gene war insgesamt vermindert, während die Thrombozytenaggregation fördernde Gene vermehrt exprimiert wurden. Schlussfolgerung: Die Genexpressionsprofile zeigen, dass es zu einer vermehrten Expression prokoagulatorischer Gene in Endothelzellen nach Elektrotrauma kommt, die den klinischen Verlauf einer progressiven Gewebsschädigung mit Thrombosen erklären kann.

Abstract

Purpose: After high-voltage electric injury, patients often show progressive tissue necrosis and thrombosis of blood vessels even remote from the entry and exit sites of electrical current. Recently, we were able to demonstrate in vivo and vitro the release of several prothrombotic factors. In this study, we report on in vitro studies performed to characterize gene expression profiles using a DNA-microarray in HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) exposed to low frequency electrical current. Methods: HUVECs were plated and grown to confluence in a culture chamber. They were exposed to 25 periods of 50 Hz sinusoidal waves. The periods had field strength of 60 V/cm and duration of 100 ms. Periods were interrupted by 10-second intervals to prevent significant joule heating. Control HUVECs were treated identically except that no electric field was applied. Samples from control and treated cells were taken after six and 24 hours. A PIQOR™ Immunology Array (Milteny Biotech) containing 1076 cDNAs was used for gene expression analysis. Hybridization of Cy3- and Cy5-labelled samples, image capture, and signal quantification of hybridized arrays were performed. Local background was subtracted from the signal to obtain the net signal intensity and the ratio of Cy5/Cy3. The ratios were normalized to the median of all ratios and the mean of the ratios of four corresponding spots was computed. More than two-fold increases or decreases of the gene expression were regarded as relevant. Results: A total of 413 genes (1 s + s) respectively 345 genes (2 s + s) could be detected. The results obtained display a distinct expression pattern of up-regulated genes known to be important for hemostasis (e.g. UPA, UPAR, ECE1, PAFAH1B1, PGT, INOS, ENOS, TPA, ICAM1, VCAM1, PAI1, PAI2, VWF, PTGDR, F3, THBD), which was most evident after 24 hours. This expression profile might lead to a hypercoagulated state. Furthermore, the expression of genes involved in angiogenesis was reduced whereas the expression of those involved in platelet formation was increased. Conclusion: Our results indicate that low frequency electrical fields induce a distinct signature of differential gene expression in exposed HUVECs. This might explain the clinical observation of thrombosis and progressive tissue necrosis after electrical injury.

Schlüsselwörter

Hochspannungsverletzung - Thrombose - Endothel - Hämostase

Key words

High-voltage electric injury - thrombosis - tissue necrosis - endothelium

Literatur

• 1 Baxter C R. Present concepts in the management of major electrical injuries.  Surg Clin North Am. 1970;  50 1401-1418
• 2 Block T A, Aarsvold J N, Matthews 2nd K L. Nonthermally mediated muscle injury and necrosis in electrical trauma.  J Burn Care Rehabil. 1995;  16 581-588
• 3 Bongard O, Fagrell B. Delayed arterial thrombosis following an apparently trivial low-voltage electric injury.  Vasa. 1989;  18 162-166
• 4 Cancio L, Jimenez-Reyna J F, Barillo D, Walker S C, McManus A T, Vaughan G M. One hundred ninety-five cases of high-voltage electric injury.  J Burn Care Rehabil. 2005;  26 331-340
• 5 Daniel R K, Ballard P A, Heroux P, Zelt R G, Howard C R. High voltage electrical injury: Acute pathophysiology.  J Hand Surg [Am]. 1988;  13 44-49
• 6 Docking P. Electrical burn injuries.  Accid Emerg Nurs. 1999;  7 70-76
• 7 Esses S I, Peters W J. Electrical burns: Pathophysiology and complications.  Can J Surg. 1981;  24 11-14
• 8 Fukao H, Matsuo O. Antithrombotic regulation in human endothelial cells by fibrinolytic factors.  Semin Thromb Hemost. 2000;  26 33-38
• 9 Gewaltig M T, Kojda G. Vasoprotection by nitric oxide: Mechanisms and therapeutic potential.  Cardiovasc Res. 2002;  55 250-260
• 10 Gross P L, Aird W C. The endothelium and thrombosis.  Semin Thromb Hemost. 2000;  26 463-478
• 11 Hammond J S, Ward C G. High-voltage electrical injuries: Management and outcome of 60 cases.  South Med J. 1988;  81 351-352
• 12 Jaffe E A, Nachman R L, Becker C G, Minck C R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.  J Clin Invest. 1973;  52 2745-2756
• 13 Mann K G, van't Veer C, Cawthern K, Butenas S. The role of the tissue factor pathway in initiation of coagulation.  Blood Coagul Fibrinolysis. 1998;  9 3-7
• 14 Patel A, Lo R. Electric injury with cerebral venous thrombosis: Case report and review of the literature.  Stroke. 1993;  24 903-905
• 15 Quinby W C, Burke J F, Trelstad, Caulfield J. The use of microscopy as a guide to primary excision of electrical burns.  J Trauma. 1978;  18 423-431
• 16 Robson M C, Murphy R C, Heggers J P. A new explanation for the progressive tissue loss in electrical injuries.  Plast Reconstr Surg. 1984;  73 431-437
• 17 Rosenberg R D, Aird W C. Vascular-bed-specific hemostasis and hypercoagulable states.  N Engl J Med. 1999;  340 1555-1564
• 18 Schena M, Shalon D, Davis R W, Brown P O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.  Science. 1995;  270 467-470
• 19 Skoog T. Electrical injuries.  J Trauma. 1970;  10 816-830
• 20 Ulrich D, Pallua N, Lichtenegger F, Hafemann B, Silny J. Influence of low frequency electric fields on anti- and pro-coagulability of the vascular endothelium: New insights into high-voltage electrical injury.  Thromb Haemost. 2004;  91 1000-1008
• 21 Vallet B. Endothelial cell dysfunction and abnormal tissue perfusion.  Crit Care Med. 2002;  30 229-234
• 22 Wilkinson C, Wood M. High-voltage electric injury.  Am J Surg. 1978;  136 693-696
• 23 Zelt R G, Daniel R K, Ballard P A, Brisette Y, Heroux P. High-voltage electrical injury: Chronic wound evolution.  Plast Reconstr Surg. 1988;  82 1027-1041