Kontrollierter Prozess zur Generierung einer azellularisierten Lebermatrix

Einleitung: Die Transplantationsmedizin kann, bedingt durch den Mangel an Spenderorganen, den Bedarf an Organersatz nur teilweise decken. Daher sind durch Tissue-Engineering auf Basis tierischer Matrices erzeugte Ersatzorgane eine attraktive Alternative. Im Vergleich zu einfachen Organen (z.B. Herzklappen) ist jedoch die Entwicklung eines dreidimensionalen, lebensgroßen Organs mit einem kompletten vaskulären Netzwerk weitaus komplexer. Zur Generierung dieser zellfreien Matrices stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Diese sind jedoch meistens sehr zeitintensiv und unterliegen keinem standardisierten Prozess. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode, in der eine azellularisierte porcine Lebermatrix in nur 24 Stunden unter standardisierten Bedingungen gewonnen wird.

Methoden: Leberexplantate aus weiblichen Göttinger Minipigs (n = 8, 24 ± 1 kg) wurden bei Entnahme portal kanüliert und mit 3L 0,9% NaCl-Lösung gespült. Nach einer Konservierung bei -80 ° C, wurden die Organe bei 4 ° C aufgetaut und kontrolliert bei 37 ° C mit 10L einer 1% Sodiumdodecylsulfatlösung (SDS) bei einem vorgegebenen Druck von 20 mmHg und einer daraus resultierenden mittleren Flussrate von 164 ml/min zirkulierend perfundiert. Die Proteinkonzentration in der SDS-Lösung wurde mittels optischer Dichte bei 280nm bestimmt. Bei Stagnation der Proteinkonzentration wurde die Leber mit 2L PBS gespült und der Prozess mit frischer SDS-Lösung erneut gestartet. Native Lebern, sowie nur mit PBS gespülte Lebern dienten als Kontrollen. In allen Lebern wurden die Konzentrationen von DNA und Glykosaminoglykane (GAGs) bestimmt. Ebenso wurde eine Hematoxylin und Eosin (H&E) Färbung durchgeführt.

Ergebnisse: Nach 24 Stunden waren die azellularisierten Matrices durchschimmernd weiß und die Proteinkonzentration in der SDS-Lösung stiegen nicht weiter an. Im Vergleich zu den nativen und mit PBS gespülten Lebern, lag die DNA Konzentration im Gewebe der azellularisierten Lebern bei 9 bzw. 10% (p < 0,0001). Die GAGs wurden durch den Azellularisierungsprozess um den Faktor 7 bzw. 5 aufkonzentriert (p < 0,0001). Die H&E Färbung zeigte kein zelluläres Material und eine intakte dreidimensionale Struktur der Extrazellulären Matrix.

Zusammenfassung: Diese Studie zeigt, dass eine porcine Leber in 24 Stunden in einem standardisierten Prozess mit 1% SDS erfolgreich azellularisiert werden kann, um ein Organgerüst zu erhalten, das für die Herstellung von Gewebsstrukturen dient. Diese standardisierten Bedingungen können auch als Grundlage für Prozessabläufe in der Gewinnung von Ersatzorganen herangezogen werden. Ein erster Einsatz von DNase im letzten Spülzyklus führte zu einer Reduktion der DNA Konzentration unter das Detektionslimit. Erste Wiederbesiedelungsversuche mit porcinen Hepatozyten zeigten, dass die Zellen das vaskuläre Netzwerk nutzen, um das Portalfeld zu erreichen und einen Zellverbund zu bilden.