Ammoniak induzierte miRNA Expressionsänderungen in kultivierten Rattenastrozyten

Einleitung: Die hepatische Enzephalopathie (HE) ist ein neuropsychiatrisches Syndrom, welches mit der zerebralen Bildung von osmotischem und oxidativ/nitrosativem Stress assoziiert ist. Ammoniak, ein Schlüsseltoxin in der Pathogenese der HE, induziert über Bildung von oxidativen Stress Astrozytenseneszenz. Die hierbei zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind nur wenig verstanden. MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende, einzelsträngige RNA Moleküle, die die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene regulieren. Da microRNAs (miRNAs) die Expression zellzyklussteuernder Gene regulieren können und ihre Expression durch oxidativen Stress moduliert werden kann, wurde in der vorliegende Studie untersucht, ob Astrozytenseneszenz durch Ammoniak-induzierte miRNA Expressionsänderungen vermittelt wird.

Methoden: Die miRNA-Expressionsanalyse in unbehandelten oder mit Ammoniak (5 mmol/l NH4Cl, 48h)-behandelten kultivierten Rattenastrozyten wurde mittels Agilent Rat miRNA Microarray durchgeführt und durch quantitative miRNA-Realtime-PCR (miQPCR) validiert. Für die Transkriptomanalyse wurde der Affymetrix Rat Genome Microarray verwendet und die gefundenen Genexpressionsänderungen wurden durch Realtime-PCR validiert. Potentielle Zielgene durch Ammoniak verringert exprimierter miRNA-Spezies wurden mithilfe bioinformatischer Tools (miRWalk) ermittelt. Die Validierung bioinformatisch vorhergesagter potentieller Zielgene erfolgte durch Transfektion kultivierter Astrozyten mit miRNA-Inhibitoren. Die Astrozytenproliferation wurde durch fluorimetrische Quantifizierung der Hoechst34580-Fluoreszenz bestimmt. Die Expression der HO-1 wurde auf Protein- und mRNA-Ebene mittels Western-Blot bzw. Realtime-PCR gemessen.

Ergebnisse: An kultivierten Astrozyten wurden mittels Microarray-basierter miRnom- und Transkriptomanalyse 43 herunterregulierte miRNA-Spezies und 142 hochregulierte Gene in NH4Cl (5 mmol/l, 48 Std.) behandelten Astrozyten identifiziert. Die durch Microarray-Analyse identifizierten miRNA- und Genexpressionsänderungen wurden nachfolgend exemplarisch durch quantitative Realtime-PCR validiert. Mithilfe bioinformatischer Analysetools wurden 43 potentielle Zielgene von durch Ammoniak-vermindert exprimierten miRNA-Spezies unter den durch Ammoniak hochregulierten Genen identifiziert. Weitere Untersuchungen fokussierten auf die Bedeutung von durch Ammoniak herunterregulierter miRNA-Spezies für die Expressionssteigerung der Hämoxygenase-1 (HO-1). Eine Inhibition von HO-1 regulierenden und durch Ammoniak herunterregulierten miRNA-Spezies steigerte die HO-1 mRNA- und Proteinexpression und hemmte die Astrozytenproliferation in HO-1-abhängiger Weise. Sowohl die Hemmung der ammoniakinduzierten Hochregulation der HO-1 durch Taurin (5 mmol/l) als auch der HO-1 Hemmstoff Zinn-Protoporphyrin IX verhinderten die ammoniakinduzierte Proliferationshemmung und Seneszenz.

Diskussion: Die Befunde der vorliegenden Studie lassen vermuten, dass Ammoniak-induzierte Astrozytenseneszenz über Expressionserniedrigungen spezifischer potentiell die HO-1 Expression regulierender miRNA-Spezies vermittelt wird, in deren Folge die HO-1 hochreguliert wird.

Korrespondierender Autor: Oenarto, Jessica

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