ICAM-1-Induktion durch CpG-ODN im murinen, orthotopen UCC-Modell – Immunhistochemische Analyse der lokalen Immunantwort auf immunstimulatorische DNA-Sequenzen

Zusammenfassung

Hintergrund Die antineoplastische Wirkung intravesikal applizierter, immunstimulatorischer CpG-Oligodesoxynukleotide in einem murinen, orthotopen Urothelzellkarzinom-Modell (C57-BL-6 /MB49) konnte bereits wiederholt nachgewiesen werden. Nach wie vor sind jedoch viele Details der Wirkweise ungeklärt. Vorangegangene Untersuchungen weisen in Richtung einer zellulären, Th1-gewichteten Immunantwort. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, mit immunhistologischen Techniken einerseits das lymphozytäre Infiltrat im behandelten Blasengewebe zu subklassifizieren, andererseits den Effekt einer topischen CpG-ODN-Konfrontation auf die Expression von ICAM-1, eines für die zelluläre Immunantwort essenziellen Oberflächenmoleküls, zu untersuchen.

Material und Methoden In einem etablierten, murinen, orthotopen UCC-Modell kamen verschiedene Instillationschemata von CpG-ODN zur Anwendung. Nach 13 Tagen wurden Gefrierschnitte der entnommenen Blasen angefertigt und immunhistochemisch auf Infiltrationsdichte CD3-, CD4-, CD8- und CD 19- exprimierender Lymphozyten untersucht. In einer zweiten Versuchsreihe am selben Tiermodell wurden gesunde und tumortragende Blasen instillativ mit CpG-ODN oder PBS behandelt und anschließend gegen das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) gefärbt.

Ergebnisse Die CpG-ODN-Instillation führt zu einer erhöhten T-Zellinfiltration. Eine weitere Subdifferenzierung zwischen T-Helfer-Zellen (CD4) und zytotoxischen T-Zellen (CD8) erbrachte keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen in Abhängigkeit vom Instillationsschema. Eine rückläufige B-Zellinfiltration im Laufe der Therapie wurde beobachtet.

Zusätzlich führt die CpG-ODN-Behandlung zu einer vermehrten Expression von ICAM-1 sowohl auf interstitiellen Leukozyten als auch Endothelien und insbesondere auf den Tumorzellen selbst.

Diskussion Die bereits in früheren Untersuchungen beobachtete vermehrte Lymphozytendichte konnte einem T-Zellinfiltrat zugeordnet werden. Die mit zunehmender Therapiedauer abnehmende B-Zelldichte spricht für eine Unterdrückung der Th2-Antwort zugunsten einer Th1-Polarisierung. Diese Ergebnisse stützen die These einer zellvermittelten Immunantwort als grundliegendem Mechanismus der antineoplastischen CpG-ODN-Wirkung. Die deutliche Steigerung der ICAM-1 Expression, vor allem auf den Tumorzellen, legt eine Schlüsselfunktion dieses Oberflächenmoleküls in der Einleitung und Aufrechterhaltung der antineoplastischen Immunantwort nahe.

Schlussfolgerung CpG-ODN könnten perspektivisch eine Alternative zu den gängigen Instillationstherapeutika darstellen. Mit Blick auf die aktuellen BCG-Engpässe und die erheblichen Nebenwirkungen ist eine Erweiterung des adjuvanten, topisch anwendbaren Armamentariums möglich. Das in dieser Arbeit erstmals gezeigte Potential einer Induktion der ICAM-1 Expression und damit einer Umkehr von Immune-Escape-Strategien solider Tumoren macht die Substanz aber auch als Adjuvanz einer modernen Checkpoint-Inhibition interessant.

Abstract

Background Immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) have been verified as an effective antineoplastic agent for intravesical application in a murine orthotopic C57-BL6 /MB-49 urothelial cell carcinoma (UCC). To date, many details in the mode of action have remained unclear. Preceding studies pointed towards a Th1-weighted response. The aim of this work was to identify the local lymphocyte subsets in murine tumour-bearing bladders and to examine effects on the expression of Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) after treatment with CpG-ODN.

Material and Methods Different instillation schedules were applied in an established orthotopic C57-BL6 /MB49 UCC model. After 13 days, fresh frozen sections of the harvested bladders were immunohistochemically examined for the infiltration density of lymphocytes expressing CD 3, CD4, CD8 and CD19. In a second series of the same animal model, healthy and tumour-bearing bladders were exposed to CpG-ODN or PBS and later stained for the expression of ICAM-1.

Results CpG-ODN instillation led to augmented T-cell infiltration (represented by CD3). Further T-cell subdifferentiation between T-helper cells (CD4) and cytotoxic T cells (CD 8a) did not show a perceptible variety between groups. The B-cell population (CD19) was found to decrease over the course of treatment. In the second series, treatment provoked a strong expression of ICAM-1 by infiltrating leukocytes, endothelial cells and particularly by the cancer cells themselves.

Discussion The previously observed augmented lymphocyte density was classified as T-cell infiltration. The decline of the B-cell concentration over the course of treatment suggests a Th2 suppression in favour of a Th-1 polarisation. These findings support the assumption that a cell-mediated immune response is the mode of action underlying the antineoplastic CpG-ODN capacities. The marked upregulation of ICAM-1 expression, especially on tumour cells, suggests a crucial role of this membrane protein for the initiation and maintenance of anticancer immune response.

Conclusion CpG-ODN might be a prospective alternative to established instillation therapies. With a view to the current BCG shortage and the well-known toxicities, an amplification of the topic therapy armamentarium could be achievable. The now described capability of ICAM-1 induction on carcinoma cells and, by association, the reversal of escape strategies to cancer immunity may also make the agent interesting as an adjuvant for modern checkpoint inhibition.

Schlüsselwörter

CpG-ODN - ICAM-1 - TLR-9 - Urothelkarzinom - Immuntherapie

Keywords

immunotherapy - CpG-ODN - ICAM-1 - toll-like receptor - urothelial cell carcinoma

Publication History

Article published online:
14 April 2021

• Literatur

• 1 Herr HW, Morales A. History of bacillus Calmette-Guerin and bladder cancer: an immunotherapy success story. J Urol 2008; 179: 53-56
• 2 Morales A, Eidinger D, Bruce AW. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors. J Urol 1976; 116: 180-183
• 3 European Association U. European Association of Urology Guidelines. 2020 Edition. Arnhem, The Netherlands: European Association of Urology Guidelines Office; 2020
• 4 Packiam VT, Werntz RP, Steinberg GD. Current Clinical Trials in Non-muscle-Invasive Bladder Cancer: Heightened Need in an Era of Chronic BCG Shortage. Curr Urol Rep 2019; 20: 84
• 5 Tokunaga T, Yamamoto H, Shimada S. et al. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG. I. Isolation, physicochemical characterization, and antitumor activity. J Natl Cancer Inst 1984; 72: 955-962
• 6 Krieg AM. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts?. Nat Med 2003; 9: 831-835
• 7 Bauer S, Kirschning CJ, Hacker H. et al. Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 9237-9242
• 8 Kawai T, Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ 2006; 13: 816-825
• 9 LaRue H, Ayari C, Bergeron A. et al. Toll-like receptors in urothelial cells--targets for cancer immunotherapy. Nat Rev Urol 2013; 10: 537-545
• 10 El Kebir D, Jozsef L, Pan W. et al. Bacterial DNA activates endothelial cells and promotes neutrophil adherence through TLR9 signaling. J Immunol 2009; 182: 4386-4394
• 11 Hegele A, Dalpke A, Barth P. et al. Antineoplastic effect of immunostimulatory DNA (CpG-ODN) in a murine C57-BL6/MB-49 transitional cell carcinoma model. Anticancer Res 2004; 24: 2225-2230
• 12 Hegele A, Dalpke A, Heeg K. et al. Immunostimulatory CpG oligonucleotides reduce tumor burden after intravesical administration in an orthotopic murine bladder cancer model. Tumour Biol 2005; 26: 274-280
• 13 Mangsbo SM, Ninalga C, Essand M. et al. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J Immunother 2008; 31: 34-42
• 14 Ninalga C, Loskog A, Klevenfeldt M. et al. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother 2005; 28: 20-27
• 15 Kawarada Y, Ganss R, Garbi N. et al. NK- and CD8(+) T cell-mediated eradication of established tumors by peritumoral injection of CpG-containing oligodeoxynucleotides. J Immunol 2001; 167: 5247-5253
• 16 Olbert PJ, Schrader AJ, Simon C. et al. In vitro and in vivo effects of CpG-Oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) on murine transitional cell carcinoma and on the native murine urinary bladder wall. Anticancer Res 2009; 29: 2067-2076
• 17 Klein D. The Tumor Vascular Endothelium as Decision Maker in Cancer Therapy. Front Oncol 2018; 8: 367
• 18 Bui TM, Wiesolek HL, Sumagin R. ICAM-1: A master regulator of cellular responses in inflammation, injury resolution, and tumorigenesis. J Leukoc Biol 2020; 108: 787-799
• 19 Murphy K, Weaver C, Seidler L. Janeway Immunologie. Berlin Heidelberg: Springer; 2018
• 20 Harjunpää H, Llort Asens M, Guenther C. et al. Cell Adhesion Molecules and Their Roles and Regulation in the Immune and Tumor Microenvironment. Frontiers in immunology 2019; 10: 1078-1078
• 21 Dustin ML. The immunological synapse. Cancer Immunol Res 2014; 2: 1023-1033
• 22 Dustin ML, Long EO. Cytotoxic immunological synapses. Immunol Rev 2010; 235: 24-34
• 23 Ikeda N, Toida I, Iwasaki A. et al. Surface antigen expression on bladder tumor cells induced by bacillus Calmette-Guerin (BCG): A role of BCG internalization into tumor cells. Int J Urol 2002; 9: 29-35
• 24 Hubbard AK, Rothlein R. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and cell signaling cascades. Free Radic Biol Med 2000; 28: 1379-1386
• 25 Verma NK, Kelleher D. Not Just an Adhesion Molecule: LFA-1 Contact Tunes the T Lymphocyte Program. J Immunol 2017; 199: 1213-1221
• 26 Haanen J, Carbonnel F, Robert C. et al. Management of toxicities from immunotherapy: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2017; 28 (Suppl. 04) iv119-iv142
• 27 Balar AV, Galsky MD, Rosenberg JE. et al. Atezolizumab as first-line treatment in cisplatin-ineligible patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet 2017; 389: 67-76
• 28 Balar AV, Castellano D, O'Donnell PH. et al. First-line pembrolizumab in cisplatin-ineligible patients with locally advanced and unresectable or metastatic urothelial cancer (KEYNOTE-052): a multicentre, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol 2017; 18: 1483-1492