Neue Nukleinsäure-Nachweisverfahren

Die klassische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist bis heute in der Routinediagnostik nur mit größter Sorgfalt verantwortlich einsetzbar. Mit dem Wunsch, Spezifität, Sensitivität sowie die Handhabung des Nukleinsäuresequenz-Nachweises weiter zu verbessern, wurden in den letzten Jahren Modifikationen der PCR und auch ganz neue Verfahren entwickelt, von denen vier verbreitete Verfahren hier vorgestellt werden. Sie beabsichtigen, wie die PCR in einem Gemisch von Nukleinsäuremolekülen bereits wenige Moleküle mit einer gesuchten Sequenz spezifisch zu erkennen und ausgehend von diesen Molekülen ein leicht messbares Signal zu generieren. Dieses wird durch zwei unterschiedlichen Strategien erreicht: Bei der sog. Zielamplifikation wird die gesuchte Nukleinsäuresequenz selbst (das sog. »target«) selektiv vervielfältigt und mit nur wenigen Markermolekülen beladen; dagegen belässt die Signalamplifikation die Konzentration der Zielsequenz und verstärkt lediglich das Detektionssignal mit einer großen Zahl von Markermolekülen auf jedem Zielmolekül. In drei der hier vorgestellten Verfahren wird als Markermolekül ein Enzym oder ein anorganischer Katalysator dazu verwendet, ein Substrat unter Lichtausstrahlung umzusetzen. Das Licht wird mit einem Luminometer gemessen und quantifiziert. Dieses Chemilumineszenz-Verfahren ist äußerst sensitiv und erlaubt kurze Messzeiten. Die Spezifität für eine jeweilige Sequenz wird bei allen vorgestellten Methoden durch eine Hybridisierungsreaktion mit einem zur Zielsequenz komplementären Oligonukleotid erzielt. Erst wenn beide ein Hybrid bilden, kommt es zur gewünschten Amplifikation. Ist die Zielsequenz verändert, z. B. bei genetischer Variabilität, fällt ihr Nachweis negativ aus. Aus diesem Grund werden genetisch möglichst konservierte Abschnitte der Zielsequenz als target gewählt.

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