In Vitro Lining of Fibronectin coated PTFE Grafts with Cryopreserved Saphenous Vein Endothelial Cells

Summary

In an attempt to produce instant endothelial cell (EC) monolayers on graft surfaces, cryopreserved cultivated human saphenous vein endothelial cells (HSVEC) were cultivated on reinforced PTFE prostheses. The graft surface was precoated with 40 μg/ml human fibronectin (HFN) prior to seeding with 200 × 10³ EC/cm². The seeding procedure was performed in a specially designed rotation device. After a cultivation period of 9 days, the seeded endothelial cells on the PTFE prostheses were exposed to shear stresses in a perfusion circuit, containing a bubble oxygenator, a roller pump and a tygon perfusion loop. The applied shear forces were 3 and 6dyn/cm², respectively. In control grafts, spontaneous cell detachment occurred from day 11 onwards and only 50% of the graft surface remained endothelialized on day 16. When the grafts were exposed to 3dyn/cm² only small cell-free areas less than 1000 urn in diameter were found after 4 hours of perfusion. In contrast, exposure to 6dyn/cm² produced discouraging results: as early as 4 hours after the onset of perfusion 50% of the graft surface was cell free. After 16 hours only 20% endothelial cell coverage was seen under the stereo microscope. However, assuming that an ideal precoating substratum can be found, the two stage technique of in vitro endothelialization of vascular grafts with autologous endothelial cells may offer a promising clinical method. Moreover, the fact that our grafts were lined with cryopreserved EC implies the possible prospect of cell banks supplying unlimited numbers of EC for subsequent bypass operations.

Zusammenfassung

In einem Versuch, eine einschichtige Auskleidung von Kunststoffgrafts mit Endothelzellen (EC) zu erzielen, wurden cryokonservierte menschliche V. saphena-Endothelzellen auf verstarkten PTFE-Prothesen kultiviert. Vor der Aussaat von 200 × 10³ EC/cm² wurde die Prothesenoberfläche mit 40 μg/ml menschlichem Fibronectin beschichtet. Die Aussaat erfolgte mittels eines eigens konstruierten Rotationsgerätes. Nach einer Kultivierungszeit von 9 Tagen wurden die auf der PTFE-Prothese ausgesäten EC Scherkräften ausgesetzt, und zwar mit Hilfe eines Perfusionssystems, das einen Bubble-Oxygenator, eine Rollerpumpe und ein Tygon-Schlauchsystem enthielt. Die angewendeten Scherkräfte betrugen 3 und 6 dyn/cm². In Kontrollprothesen fand vom 11. Tag an eine spontane Zellablösung statt. Am 16. Tag waren nur noch 50% der Prothesenoberfläche endothelialisiert. Wenn die Prothesen einer Wirkung von 3 dyn/cm² ausgesetzt waren, fanden sich nach 4stündiger Perfusion nur kleine zellfreie Areale von wenigerals 1000 μm im Durchmesser. Dagegen führte die Anwendung von 6 dyn/cm² zuentmutigenden Resultaten: bereits 4 Stunden nach Einsetzen der Perfusion waren 50% der Prothesenoberfläche zellfrei. Nach 16 Stunden waren nur noch 20% der Endothelzellschicht unterdem Mikroskopsichtbar. Unterder Annahme, daß sich ein ideales Beschichtungssubstrat finden läßt, kann die zweizeitige Operationstechnik der In-vitro-Endothelialisierung der Gefäßprothesen mit autologen Endothelzellen eine vielversprechende klinische Methode werden. Die Auskleidung unserer Prothesen mit cryokonservierten EC impliziert möglicherweise die Aussicht auf Zellbanken zur Herstellung einer unbegrenzten Anzahl von EC für vorgesehene Bypassoperationen.

Key words

Cultured endothelial cells - Vascular grafts - Fibronectin - Cryopreservation