Etablierung und Evaluierung von ln-vitro-Sensibilitätstestungen an Aspergillus fumigatus mittels Mikrodilutionsverfahren

Zusammenfassung

Für die In-vitro-Sensibilitätstestung von Schimmeln werden unterschiedliche Testverfahren wie Makro- und Mikrodilutionstests sowie Agardiffusionstests in unterschiedlichen Nährmedien beschrieben, jedoch hat sich bisher kein standardisiertes Testverfahren durchgesetzt. Ziel der hier berichteten Studie ist es, ein Mikrodilutionstest zu etablieren und zu evaluieren, mit dem die Chemosensitivität von Aspergillus fumigatus ohne Oberflächensporulation und relativ inokulumsunabhängig getestet werden kann. Als Referenzsubstanzen wurden bei diesen Testungen die zwei gut wasserlöslichen, systemisch verfügbaren Antimykotika Amphotericin B (CAS 1397-89-3) und 5-Flucytosin (CAS 2022-85-7) eingesetzt. Bei der Bestimmung der MHK-Werte (mittlere Hemmkonzentrationen) an 50 klinischen Isolaten von A. fumigatus zeigten die Keime in Isosensitest (ISO)-Medium ein schnelleres Wachstum als in Yeast-Nitro-gen-Glucose (YNG)-Medium. Das Wachstum war während des Untersuchungszeitraumes submers im Medium adhärent am Boden der Mikrotiterplatte. Das oberflächliche Wachstum mit Sporulation setzte erst spät ein. Es fand sich nur ein geringfügiger Inokulumeffekt, und die MHK-Werte waren sowohl bei der Ablesung mittels ELISA-Reader wie auch bei der makroskopischen Ablesung nahezu gleich und mit eindeutigem Bruchpunkt zu ermitteln. Für Amphotericin B wurden in ISO-Medium niedrigere MHK-Werte (0,25-2µg/ml; Median M = 1 µg/ml) als in YNG-Medium (0,25-2 µg/ml; M = 1 µg/ml) ermittelt. Für 5-Flucytosin zeigten sich in beiden Medien MHK-Werte von ≥ 32 µg/ml mit einem Median von 64 µg/ml in ISOMedium und 128 µg/ml in YNG-Medium. Die Chemosensibilitätstestung an A. fumigatus-Stämmen ließ sich somit gut standardisieren und kann in der dargestellten Form mit vertretbarem Aufwand durchgeführt werden. Inwieweit die In-vitro-Sensibilitätsdaten mit der In-vivo-Sensibilität korrelieren, ist durch Tierversuchsmodelle bzw. klinische Studien zu evaluieren. Erst dann sollten therapeutische Konsequenzen aus den erhobenen In-vitro-Daten gezogen werden.

Summary

Establishment and Evaluation of Microdilution Assays for the in vitro Sensitivity Testing of Aspergillus fumigatus

For the in vitro sensitivity assessment of moulds different methods of micro- and macrodilution assays as well as agar diffusion assays in different media formulations have been described so far. Until now, no standardized method has been preferred. The aim of the present study is to establish and to evaluate a microdilution assay for the in vitro chemosensitivity testing of Aspergillus fumigatus. This method should show a late onset of superficial growth and sporulation as well as a relative independency of the test inoculum. As reference substances, amphotericin B (CAS 1397-89-3) and 5-fluorocytosine (CAS 2022-85-7), which are both used for therapy of systemic mycoses, have been tested. Both substances show an excellent water solubility in liquid media. Fifty clinical isolates of A. fumigatus were used for the testings. The strains showed a better growth in Isosensitest (ISO)-medium than in Yeast-Nitrogen-Glucose (YNG)-medium. Growth was submers during the observation time, adherent to the bottom of the microtiter plate. Superficial growth with sporulation only occurred in a late stage of growth. Only a weak inoculum effect could be observed and the MIC (minimal inhibitory concentration) values determined macroscopically as well as using an ELISA reader showed to be almost comparable with a clearly defined breakpoint for the MIC discrimination. For amphotericin B, lower MIC values were observed in ISO-medium (0.25-2 µg/ml; median M = 1 µg/ml) than in YNG-medium (0.25 µg/ml; M = 1 µg/ml). For 5-fluorocytosine, in both media MIC-values of ≥ 32 µg/ml with a median of 64 µg/ml in ISO-medium and 128 µg/ml in YNG-medium were observed, respectively. With this test procedure, a standardized chemosensitivity testing can be performed for strains of A. fumigatus by a test system which is relatively easy to handle. These in vitro sensitivity data have to be correlated with clinical data as well as data obtained from animal studies. Only after this assessment final therapeutic consequences should be drawn from these in vitro findings.

Key words

Amphotericin B - Aspergillus fumigatus, in vitro sensitivity testing - CAS 1397-89-3 - CAS 2022-85-7 - 5-Fluorocytosine