Mutational Analysis of the RET and GDNF Gene in Children with Hypoganglionosis

Summary

Germline mutations of the RET (10 q11.2) have been reported in Hirschsprung's disease (HSCR) at a rate of 15 - 45 %. Recently, the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) was identified as one of the ligands of the RET, and GDNF (5 p12-p13.1) mutations were also found in association with RET mutations in HSCR patients. We analysed the DNA sequence of RET and the GDNF of patients with hypoganglionosis. We investigated the germline mutation in 5 patients histologically diagnosed with hypoganglionosis. DNAs were extracted from peripheral blood lymphocytes of these patients. The PCR primers were designed for RET tyrosine kinase domain (exon 13 - 17) and GDNF (exon 1 - 2). The DNA sequence was determined using a direct DyeDeoxy Terminator Cycle method. The analysis of RET showed silent mutation at the codon 769 (CTT → CTG) by DNA polymorphism in all patients. No other mutation of the RET or GDNF was evident. These results suggest that the RET or GDNF may not contribute to the pathogenesis of hypoganglionosis, which is suspected to be genetically different from HSCR.

Résumé

La mutation de la lignée RET (10 q11.2) a été décrite dans la maladie de Hirschsprung (HSCR) avec une fréquence de 15 - 45 %. Récemment le facteur neurotrophique de la lignée gliale (GDNF) était identifié comme un des ligands du RET et les mutations de GDNF étaient retrouvées en association avec les mutations de RET chez les patients HSCR. Nous analysons la séquence DNA de RET et le GDNF des patients avec hypoganglionose. Nous étudions la mutation chez 5 patients avec hypoganglionose. Les DNA étaient extraits de lymphocytes du sang périphérique. Les amorces de la PCR étaient conçues pour la séquence RET tyrosine kinase (exon 13 - 17) et GDNF (exon 1 - 2). La séquence DNA était déterminée utilisant une méthode directe DyeDeoxy Terminator Cycle. L'analyse du RET montrait une mutation silencieuse au codon 769 (CTT-CTG) par polymorphisme du DNA chez tous les patients. Aucune autre mutation de RET ou de GDNF n'était évidente. Ces résultats suggèrent que le RET ou GDNF n'interviennent pas dans la pathogénie de l'hypoganglionose, qui est probablement génétiquement différent de HSCR.

Resumen

Se han publicado mutaciones germinales del gen RET (10 q11.2) en la enfermedad de Hirschsprung (HSCR) con una frecuencia de 15 a 45 %. Más recientemente se identificó el factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GNDF) como uno de los ligandos de RET y se hallaron mutaciones de GNDF (5 p12-p13.1) asociadas a las de RET en pacientes con HSCR. Analizamos la secuencia del DNA de RET y GDNF en niños con hipoganglionosis. Investigamos la mutación germinal en 5 pacientes con este diagnóstico histológico. Se extrajo el DNA de linfocitos periféricos. Se usaron primers para el dominio de la tirosin-kinasa RET (exon 13 - 17) y GNDF (exones 1 - 2). La secuencia de DNA se determinó usando el método ciclo directo DyeDeoxy Terminator. El análisis del RET mostró una mutación silente del codon 769 (CTT-CTG) por polimorfismo DNA en todos los pacientes. No se vieron otras mutaciones de RET ni GNDF. Estos resultados sugieren que RET y GNDF no contribuyen a la patogenia de la hipoganglionosis, que es aparentemente diferente de la de HSCR.

Zusammenfassung

Keimbahn-Mutationen des RET-Gens (10q11.2) wurden beim Morbus Hirschsprung (HSCR) in 15 bis 45 % der Fälle beschrieben. In jüngster Zeit wurde GDNF (glial cell derived neurotrophic factor) als einer der RET-Liganden identifiziert; außerdem wurden Mutationen im GDNF (5p12-p13.1) gefunden, die mit RET-Mutationen bei Patienten mit Morbus Hirschsprung assoziiert waren. Wir analysierten die DNA-Sequenzen von RET und GDNF aus Patienten mit Hypoganglionose. Wir untersuchten die Keimbahn-Mutationen von 5 Patienten mit diagnostizierter Hypoganglionose. DNA wurde aus peripheren Blutlymphozyten dieser Patienten extrahiert. Die PCR-Primer wurden für die Bindung in der Tyrosinkinase-Domäne von RET (Exon 13 - 17) bzw. in Exon 1 - 2 von GDNF entworfen. Die PCR fand unter Verwendung von Farbstoff-Desoxy-Terminatoren statt zur direkten Sequenzierung der DNA. Die Analyse von RET zeigte eine stille Mutation in Codon 769 (CTT → CTG; DNA-Polymorphismus bei allen Patienten). Keine andere Mutation in RET oder GDNF wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse legen nahe, dass RET und GDNF möglicherweise nicht zur Pathogenese der Hypoganglionose beitragen, die vermutlich andere genetische Ursachen hat als der Morbus Hirschsprung.

Key words

Hirschsprung's disease - Hypoganglionosis - RET - GDNF

Mots-clés

Maladie de Hirschsprung - Hypoganglionose - RET - GDNF

Palabras clave

Hirschsprung - Hipoganglionismo - RET - GNDF

Schlüsselwörter

Morbus Hirschsprung - Hypoganglionose - RET - GDNF

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