Effects of Whole-Body Hypoxic Preconditioning on Hypoxia/Reoxygenation-Induced Intestinal Injury in Newborn Rats

Abstract

Purpose: The precise cause of necrotizing enterocolitis (NEC) is elusive. Ischemia and reperfusion injury of the intestine has been considered to be a major contributing factor for NEC. Ischemic preconditioning is defined as one or more brief periods of ischemia with intermittent reperfusion that protects tissues against a sustained period of subsequent ischemia. Contribution of preconditioning to hypoxia/reoxygenation-induced intestinal injury in newborn rats has not been evaluated previously. Methods: The study was carried out on 1-day-old Wistar albino rat pups. Whole-body hypoxia and reoxygenation (H/R) was achieved by 10 min hypoxia using 95 % N₂ + 5 % CO₂ followed by 10 min reoxygenation with 100 % oxygen. Whole body hypoxic preconditioning (HP) cycles were performed with 3 min hypoxia and 5 min reoxygenation. Thirty-three pups were randomly allocated into 4 groups. Group 1 served as untreated controls. The pups in group 2 were subjected to H/R only. In groups 3 and 4, 1 cycle and 3 cycles of HP were performed prior to H/R, respectively. Animals were killed at the end of the protocols. Intestine specimens were obtained to determine the histological changes, as well as to measure the tissue malondialdehyde (MDA) and nitric oxide (NO) levels, and xanthine oxidase (XO) and myeloperoxidase (MPO) activities. Results: The microscopic lesions in H/R rat pups were virtually the same as those seen in neonatal NEC, with severe destruction of villi and crypts, in some cases extending to the muscularis. In both HP groups, the lesions were found to be milder. H/R resulted in a marked elevation in MDA and NO levels, and XO and MPO activities compared to the untreated controls. Both 1 cycle and 3 cycles of HP prior to H/R resulted in an obvious decrease in all biochemical parameters. Differences of the biochemical results between both HP groups were not statistically significant. Conclusion: This study revealed that whole-body hypoxic preconditioning is beneficial for hypoxia/reoxygenation-induced intestinal injury in newborn rats.

Résumé

But: La cause précise de l'entérocolite nécrosante (NEC) est encore floue. L'ischémie et l'agression dû à la reperfusion de l'intestin sont considérés comme étant un des facteurs majeurs responsables de NEC. Le pré-conditionnement ischémique est défini comme un ou plusieurs bref(s) épisode(s) d'ischémie avec une reperfusion intermittente qui protège les tissus contre une période plus prolongée d'ischémie. Le pré-conditionnement au traumatisme hypoxie/réoxygénation n'a jamais été étudié au préalable chez le rat nouveau-né. Méthodes: L'étude a été réalisée sur des rats albinos Wistar de 1 jour de vie. L'hypoxie de l'ensemble du corps et la réoxygénation (H/R) étaient réalisés par 10 minutes d'hypoxie en utilisant un mélange 95 % de N₂ + 5 % de CO₂ suivies par 10 minutes de réoxygénation sous 100 % d'oxygène. Les cycles de pré-conditionnement (HP) étaient réalisés par 3 minutes de réoxygénation. 32 rats étaient divisés en 4 groupes. Le groupe 1 était le groupe contrôle non traité, le groupe 2 était soumis à H/R seulement. Dans les groupes 3 et 4, 1 cycle et 3 cycles de HP étaient réalisés avant H/R. Les animaux étaient tués à la fin du protocole. Des biopsies intestinales étaient obtenues pour déterminer les modifications histologiques ainsi qu'utilisées pour mesurer la malondialdehyde (MDA), le niveau d'oxyde nitrique (NO), de xanthine oxydase (XO) et de myélopéroxydase (MPO). Résultats: Les lésions microscopiques dans le groupe H/R étaient les mêmes que celles vues en cas d'entérocolite nécrosante néonatale avec une destruction sévère des villosités des cryptes, dans quelques cas étendues à la musculaire. Dans les deux groupes HP, les lésions étaient retrouvées moins importantes. H/R entraînait une élévation marquée de MDA et de NO, et des activités XO et MPO comparées au groupe non traité. Les deux types 1 ou 3 cycles de HP avant H/R entraînaient une diminution importante des paramètres biochimiques. Les différences des résultats biochimiques dans les deux groupes HP n'étaient pas significatifs. Conclusion: Cette étude révèle que le pré-conditionnement total est bénéfique sur les lésions d'hypoxie/réoxygénation chez le nouveau-né de rat.

Resumen

Objetivos: La causa exacta de la enterocolitis necrotizante (NEC) es desconocida. Las lesiones de isquemia/reperfusión del intestino han sido consideradas como factores contribuyentes mayores. Se define el precondicionamiento isquémico como uno o más periodos breves de isquemia con reperfusión intermitente que protegen los tejidos contra un periodo subsiguiente de isquemia prolongada. La contribución del precondicionamiento a las lesiones intestinales inducidas por hipoxia/reoxigenación en ratas recién nacidas nunca ha sido estudiada anteriormente. Métodos: El estudio se realizó con ratas Wistar albinas de 1 día de edad. Se consiguió una hipoxia y reoxigenación (H/R) corporal total de 10 minutos usando N₂ al 95 % + CO₂ al 5 % seguida de 10 minutos de reoxigenación con oxígeno al 100 %. Los ciclos de precondicionamiento hipóxico (HP) se consiguieron con 3 minutos de reoxigenación. Se dividieron randomizadamente 33 ratas en 4 grupos. El grupo 1 sirvió como control sin tratamiento. El grupo 2 recibió H/R solamente. En los grupos 3 y 4 se suministraron 1 y 3 ciclos de HP antes de la H/R respectivamente. Los animales fueron sacrificados al final del protocolo. Se obtuvieron muestras de intestino para determinar los cambios histológicos así como para medir las actividades de malon-dialdehido (MDA), óxido nítrico (NO), xantino-oxidasa (XO) y mielo-peroxidasa (MPO) tisulares. Resultados: Las lesiones microscópicas en ratas con H/R fueron virtualmente las mismas que las que se ven en la NEC neonatal con destrucción severa de los villi y de las criptas que en algún caso se extendían hasta la muscular. En ambos grupos HP las lesiones eran más leves. La H/R causó una elevación marcada de MDA, NO, XO y MPO en comparación con controles sin tratamiento. Tanto 1 como 3 ciclos de HP antes de H/R causaron una disminución obvia de todos los parámetros bioquímicos. Las diferencias de los resultados bioquímicos entre ambos grupos HP no fueron estadísticamente significativas. Conclusión: Este estudio revela que el precondicionamiento hipóxico corporal total es beneficioso sobre la lesión intestinal de H/R en ratas recién nacidas.

Zusammenfassung

Zielsetzung: Die genaue Ursache der nekrotisierenden Enterokolitis ist nicht bekannt. Ischämie und Reperfusionsschäden der Darmwand wurden als Hauptfaktor betrachtet. Die ischämischen Vorbedingungen sind definiert als mehr oder weniger kurze Perioden von Durchblutungsstörungen, die von intermittierender Reperfusion unterbrochen werden und das Gewebe gegen eine konsequente, anhaltende Ischämie schützen könnten. Dieser Wechsel von Hypoxie und Reoxygenierung des intestinalen Gewebes wurde bisher nicht näher untersucht und wird in der folgenden Arbeit an neugeborenen Ratten überprüft. Material und Methodik: Bei ein Tag alten Wistar-Albinorattenbabys wurde eine vollständige Hypoxie/Reoxygenierung (H/R) durchgeführt. Dabei wurde eine 10-minütige Hypoxie mit 25 %igem N₂ und 5 %igem CO₂ durchgeführt. Diese Periode war gefolgt von einer 10-minütigen Reoxygenierung mit 100 %igem Sauerstoff. Die Gesamtkörper-Hypoxiezyklen betrugen 3 Minuten, die Reoxygenierungszeit 5 Minuten. 33 Baby-Ratten wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Die Gruppe 1 entsprach einer nicht behandelten Kontrollgruppe, die Gruppe 2 wurde einer einzigen Hypoxie und Reoxygenierung, die Gruppen 3 und 4 wurden einem Zyklus und 3 weiteren Zyklen vor einer Hypoxie und Reoxygenierung unterzogen. Die Tiere wurden am Ende des Protokolls sakrifiziert. Das entnommene Dünndarmgewebe wurde histologisch untersucht und die Malondialdehyde (MDA)- und die Stickstoffmonoxid (NO)-Spiegel sowie die Aktivität der Xanthinoxydase (XO) und der Myeloperoxidase (MPO) gemessen. Ergebnisse: Die mikroskopischen Ergebnisveränderungen bei den Hypoxie/Reoxygenierungsratten waren die gleichen wie bei der neugeborenen, nekrotisierenden Enterokolitis mit schwerer Zerstörung der Villi und Krypten, die in manchen Fällen bis in die Muskularis hineinreichten. Bei beiden Hypoxie- und Präkonditionierungsmodalitäten (HP-Gruppen) waren die Defekte jedoch leichter. Hypoxie und Reoxygenierung führten zu deutlich erhöhten MDA- und NO-Spiegeln sowie einer gesteigerten XO- und MPO-Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. Sowohl die einzyklische wie die dreizyklische Präkonditionierung von Hypoxieintervallen vor Hypoxie und Reoxygenierung führten zu einem deutlichen Absinken aller biochemischen Parameter. Die Unterschiede der biochemischen Ergebnisse zwischen den HP-Gruppen waren jedoch nicht statistisch signifikant. Schlussfolgerung: Die Untersuchung zeigt, dass eine Gesamtkörperhypoxie-Präkonditionierung nützlich ist im Hinblick auf die Hypoxie/Reoxygenierung intestinaler Schäden bei neugeborenen Ratten.

Key words

Ischemia reperfusion injury - necrotizing enterocolitis - ischemic preconditioning

Mots-clés

Ischémie reperfusion - entérocolite nécrosante - pré-conditionnement à l'ischémie

Palabras clave

Lesión de isquemia reperfusión - enterocolitis necrotizante - precondicionamiento isquémico

Schlüsselwörter

Ischämie - Reperfusion - nekrotisierende Enterokolitis - ischämische Präkonditionierung

References

• 1 Akisu M, Baka M, Yalaz M, Huseyinov A, Kultursay N. Supplementation with Saccharomyces boulardii ameliorates hypoxia/reoxygenation-induced necrotizing enterocolitis in young mice.  Eur J Pediatr Surg. 2003;  13 319-323
• 2 Akisu M, Kullahcioglu Girgin F, Baka M, Husseyinov A, Kultursay N. The role of recombinant human erythropoietin in lipid peroxidation and platelet-activating factor generation in a rat model of necrotizing enterocolitis.  Eur J Pediatr Surg. 2001;  11 167-172
• 3 Aksoyek S, Cinel I, Avlan D, Cinel L, Ozturk C, Gurbuz P. et al . Intestinal ischemic preconditioning protects the intestine and reduces bacterial translocation.  Shock. 2002;  18 476-480
• 4 Albuquerque R G, Sanson A J, Malangoni M A. Allopurinol protects enterocytes from hypoxia-induced apoptosis in vivo.  J Trauma. 2002;  53 415-420
• 5 Baines C P, Goto M, Downey J M. Oxygen radicals released during ischemic preconditioning contribute to cardioprotection in the rabbit myocardium.  J Mol Cell Cardiol. 1997;  29 207-216
• 6 Cardillo C, Kilcoyne C M, Cannon R O, Quyyumi A A, Panza J A. Xanthine oxidase inhibition with oxypurinol improves endothelial vasodilator function in hypercholesterolemic but not in hypertensive patients.  Hypertension. 1997;  30 57-63
• 7 Chan K L, Ng S P, Chan K W, Wo Y H, Tam P K. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis: a study of the role of intraluminal pressure, age and bacterial concentration.  Pediatr Surg Int. 2003;  19 573-577
• 8 Chandler J C, Hebra A. Necrotizing enterocolitis in infants with very low birth weight.  Semin Pediatr Surg. 2000;  9 63-72
• 9 Cinel I, Avlan D, Cinel L, Polat G, Atici S, Mavioglu I. et al . Ischemic preconditioning reduces intestinal epithelial apoptosis in rats.  Shock. 2003;  19 588-592
• 10 Clark D A, Fornabaio D M, McNeill H, Mullane K M, Caravella S J, Miller M J. Contribution of oxygen-derived free radicals to experimental necrotizing enterocolitis.  Am J Pathol. 1988;  130 537-542
• 11 Cortas N K, Wakid N W. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method.  Clin Chem. 1990;  36 1440-1443
• 12 Draper H, Hadley M. Malondialdehyde determination as index of lipid peroxidation.  Methods Enzymol. 1990;  186 421-431
• 13 Edelson M B, Bagwell C E, Rozycki H J. Circulating pro- and counterinflammatory cytokine levels and severity in necrotizing enterocolitis.  Pediatrics. 1999;  103 766-771
• 14 Ford H, Watkins S, Reblock K, Rowe M. The role of inflammatory cytokines and nitric oxide in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.  J Pediatr Surg. 1997;  32 275-282
• 15 Gozal D, Gozal E, Reeves S R, Lipton A J. Gasping and autoresuscitation in the developing rat: effect of antecedent intermittent hypoxia.  J Appl Physiol. 2002;  92 1141-1144
• 16 Greene E L, Paller M S. Xanthine oxidase produces O₂ ^- in posthypoxic injury of renal epithelial cells.  Am J Physiol. 1992;  263 251-255
• 17 Hsueh W, Caplan M S, Qu X W, Tan X D, De Plaen I G, Gonzalez-Crussi F. Neonatal necrotizing enterocolitis: clinical considerations and pathogenetic concepts.  Pediatr Dev Pathol. 2003;  6 6-23
• 18 Koltuksuz U, Irmak M K, Karaman A, Uz E, Var A, Ozyurt H. et al . Testicular nitric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsion in rats pretreated with caffeic acid phenethyl ester.  Urol Res. 2000;  28 360-363
• 19 Koltuksuz U, Ozen S, Uz E, Aydinc M, Karaman A, Gultek A. et al . Caffeic acid phenethyl ester prevents intestinal reperfusion injury in rats.  J Pediatr Surg. 1999;  34 1458-1462
• 20 Love S. Oxidative stress in brain ischemia.  Brain Pathol. 1999;  9 119-131
• 21 Lowry O H, Rosenbrough N J, Fart A L, Randall R J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent.  J Biol Chem. 1951;  193 265-275
• 22 McCallion K, Wattanasirichaigoon S, Gardiner K R, Fink M P. Ischemic preconditioning ameliorates ischemia- and reperfusion-induced hyperpermeability in rats.  Shock. 2000;  14 429-434
• 23 McCord J M, Roy R S. The pathophysiology of superoxide: roles in inflammation and ischemia.  Can J Physiol Pharmacol. 1982;  60 1346-1352
• 24 Miura T, Miura T, Kawamura S, Goto M, Sakamoto J, Tsuchida A. et al . Effect of protein kinase C inhibitors on cardioprotection by ischemic preconditioning depends on the number of preconditioning episodes.  Cardiovasc Res. 1998;  37 700-709
• 25 Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.  Circulation. 1986;  74 1124-1136
• 26 Okur H, Kucukaydin M, Kose K, Kontas O, Dogam P, Kazez A. Hypoxia-induced necrotizing enterocolitis in the immature rat: the role of lipid peroxidation and management by vitamin E.  J Pediatr Surg. 1995;  30 1416-1419
• 27 Ostadalova I, Ostadal B, Jarkovska D, Kolar F. Ischemic preconditioning in chronically hypoxic neonatal rat heart.  Pediatr Res. 2002;  52 561-567
• 28 Ozturk H, Dokucu A I, Ogun C, Buyukbayram H. Protective effects of recombinant human interleukin-10 on intestines of hypoxia-induced necrotizing enterocolitis in immature rats.  J Pediatr Surg. 2002;  37 1330-1333
• 29 Palma-Vargas J M, Toledo A H, Garcia Criado F J, Misawa K, Lopez-Neblina F, Toledo-Pereyra L H. 21-Aminosteroids block neutrophil infiltration and provide liver protection independent of NO₂-NO₃ levels.  J Surg Res. 1996;  66 131-137
• 30 Powell R W, Dyess D L, Collins J N, Roberts W S, Tacchi E J, Swafford A N. et al . Regional blood flow response to hypothermia in premature, newborn, and neonatal piglets.  J Pediatr Surg. 1999;  34 193-198
• 31 Prajda N, Weber G. Malignant transformation-linked imbalance: decreased xanthine oxidase activity in hepatomas.  FEBS Lett. 1975;  59 245-249
• 32 Sandhu R, Diaz R J, Mao G D, Wilson G J. Ischemic preconditioning: differences in protection and susceptibility to blockade with single-cycle versus multicycle transient ischemia.  Circulation. 1997;  96 984-995
• 33 Sener G, Akgun U, Satiroglu H, Topaloglu U, Keyer-Uysal M. The effect of pentoxifylline on intestinal ischemia/reperfusion injury.  Fundam Clin Pharmacol. 2001;  15 19-22
• 34 Sibbons P D, Spitz L, van Velzen D. Collateral blood flow in the distal ileum of neonatal piglets: a clue to the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.  Pediatr Pathol. 1992;  12 15-27
• 35 Somogyi M. A method for the preparation of blood filtrates for the determination of sugar.  J Biol Chem. 1930;  86 655-663
• 36 Squadrito F, Altavilla D, Ammendolia L, Squadrito G, Campo G M, Sperandeo A. et al . Improved survival and reversal of endothelial dysfunction by the 21-aminosteroid, U-74389 G in splanchnic ischaemia-reperfusion injury in the rat.  Br J Pharmacol. 1995;  115 395-400
• 37 Sun Z, Olanders K, Lasson A, Dib M, Annborn M, Andersson K. et al . Effective treatment of gut barrier dysfunction using an antioxidant, a PAF inhibitor, and monoclonal antibodies against the adhesion molecule PECAM-1.  J Surg Res. 2002;  105 220-233
• 38 Vaughan W G, Horton J W, Walker P B. Allopurinol prevents intestinal permeability changes after ischemia-reperfusion injury.  J Pediatr Surg. 1992;  27 968-972
• 39 Wei H, Frenkel K. Relationship of oxidative events and DNA oxidation in SENCAR mice to in vivo promoting activity of phorbol ester-type tumor promoters.  Carcinogenesis. 1993;  14 1195-1201
• 40 Zhang S X, Miller J J, Gozal D, Wang Y. Whole-body hypoxic preconditioning protects mice against acute hypoxia by improving lung function.  J Appl Physiol. 2004;  96 392-397