Formation of Spheroidal Aggregates of Hepatocytes on Biodegradable Polymers Under Continuous-Flow Bioreactor Conditions*

Abstract

Our laboratory has investigated heterotopic hepatocyte transplantation on biodegradable polymer matrices as an experimental treatment for end-stage liver disease. One of the limitations has been survival of sufficient cell mass after transplantation. We hypothesize that in vitro conditioning of cells within polymer matrices prior to implantation may increase hepatocyte survival and function. In this preliminary study we investigated the effect of continuous flow on hepatocytes and sinusoidal endothelial cells on poly-L-lactic acid (PLLA) discs in vitro. Highly porous PLLA discs were manufactured measuring 18 mm diameter by 1 mm thickness using previously described techniques. Hepatocytes were isolated from adult, male Lewis rats (200-300 g) using a two-step collagenase digestion. Sinusoidal endothelial cells were isolated using a two-step collagenase digestion, differential sedimentation, Percoll gradient centrifugation, and selective adherence. PLLA discs were seeded with hepatocytes alone or with co-cultures of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells. Seeded discs were then secured within a flow bioreactor chamber and exposed to continuous flow of culture media at a rate of 20 ml/minute through the chamber. Seeded discs placed in static culture conditions served as controls. Specimens seeded with only hepatocytes were harvested at 24 hours, 48 hours, and 168 hours after seeding. Co-culture specimens were harvested after 168 hours. Specimens were viewed under phase-contrast microscopy and then formalin-fixed and prepared for histologic sectioning. Sections were stained with Hematoxylin and Eosin and then analyzed with light microscopy.

Hepatocytes under flow conditions formed spheroidal aggregates of cells of 50 to 200 µm in diameter by 24 hours in culture. Hepatocytes in static conditions showed decreased aggregation of cells and spheroid formation was absent. Co-cultured specimens under flow also showed spheroid formation with endothelial cells lining the outside of hepatocyte spheroids. Co-cultured specimens in static culture showed no spheroid formation and no organization between sinusoidal endothelial cells and hepatocytes. These results suggest that continuous flow increases organization of hepatocytes cultured within biodegradable polymer matrices.

Zusammenfassung

Unser Labor hat die heterotope Transplantation von Hepatozyten auf biologisch abbaubaren Polymermatrizes als experimentelle Behandlungsmethode bei Leberversagen untersucht. Einer der begrenzenden Faktoren war das Überleben einer ausreichenden Zellmenge nach der Transplantation. Unsere Arbeitshypothese ist, daß das Überleben und die Funktion der Hepatozyten durch in vitro Konditionierung der Zellen innerhalb der Polymermatrix vor der Implantation verbessert werden kann. In dieser Pilotstudie untersuchten wir den Effekt von kontinuierlichem Kulturmediumfluß auf Hepatozyten und sinusoidale Endothelzellen auf einer Poly-L-Lactat(PLLA)Scheibe in vitro. Hochporöse PLLA Scheiben wurden in den Abmessungen von 18 mm Durchmesser mal 1 mm Dicke nach bereits beschriebener Technik hergestellt. Hepatozyten wurden von erwachsenen, männlichen Lewis-Ratten (200-300 g) mittels einer Zwei-Schritt-Collagenase-Verdauungstechnik isoliert. Sinusoidale Endothelzellen wurden mittels einer Zwei-Schritt-Collagenase-Verdauungstechnik, einer differentiellen Sedimentation, einer Percollgradienten Zentrifugation und einer selektiven Anheftung isoliert. Die PLLA Scheiben wurden entweder mit Hepatozyten alleine oder mit einer Co-Kultur von Hepatozyten und sinusoidalen Endothelzellen besiedelt. Die so besiedelten Scheiben wurden dann innerhalb der Flußkammer des Bioreaktors verankert und einer Flußrate von 20 ml/min Kulturmediumfluß ausgesetzt. Als Kontrollgruppe dienten gleichsam besiedelte PLLA Scheiben unter statischen Kulturbedingungen. Die nur mit Hepatozyten besiedelten Scheiben wurden nach 24, 48 und 168 Stunden entnommen. Die Co-Kultur Proben wurden nach 168 Stunden gewonnen. Die Proben wurden unter dem Phasenkontrastmikroskop betrachtet, dann formalinfixiert und histologisch aufgearbeitet. Die Schnitte wurden mit Hematoxylin & Eosin angefärbt und dann lichtmikroskopisch ausgewertet. Die Hepatozyten unter Flußkulturbedingungen bildeten spheroidale Zellaggregate von 50 bis 200 µm im Durchmesser schon nach 24 Stunden in Kultur. Die Hepatozyten in statischer Kultur zeigten weniger Aggregationsverhalten, und Spheroidformationen waren nicht zu beobachten. Proben aus der Co-Kultur unter Flußbedingungen zeigten ebenfalls Spheroidformationen, wobei die Endothelzellen die Oberfläche der Hepatozytenspheroide bedeckten. Co-Kultur-Proben in statischer Kultur zeigten keine Spheroidformation und keine Organisation zwischen den sinusoidalen Endothelzellen und den Hepatozyten. Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß Flußkulturbedingungen den Organisationsgrad von Hepatozyten in Kultur auf biologisch abbaubaren Polymermatrizes erhöhen.

Key words

Tissue engineering - Biodegradable polymer - Cell transplantation - Hepatocyte - Bioreactor

Schlüsselwörter

Tissue Engineering - Biologisch abbaubare Polymere - Zelltransplantation - Hepatozyten - Biorekator