Systembiologie in der Ophthalmologie – innovative Wirkstoffidentifikation zur spezifischen Vermeidung postoperativer Fibrose

Zusammenfassung

Hintergrund Der Langzeiterfolg fistulierender Therapiekonzepte zur Behandlung des Glaukoms wird im Wesentlichen durch überschießende Vernarbungsreaktionen (Fibrose) limitiert. Zytostatika wie Mitomycin C können die Fibrose zwar verhindern, sind jedoch häufig mit Nebenwirkungen assoziiert. Spezifisch wirkende Antifibrotika sind derzeit nicht im klinischen Einsatz. Daher beschreibt diese Studie einen systembiologischen Ansatz, mit dem durch eine dedizierte Bioinformatik-Technologieplattform Wirkstoffe identifiziert und als Antifibrotikum repositioniert werden können.

Material und Methoden Als Basis für den Wirkstoffidentifikationsprozess wurden differenzielle Genexpressionsdaten humaner Tenon-Fibroblasten (hTF) genutzt, die von unbehandelten hTF und von mit Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) stimulierten hTF („fibrotische Fibroblasten“) mittels Next-Generation Sequencing (NGS) erhoben wurden. Diese Daten wurden mit dem bioinformatischen Werkzeug „FocusHeuristics“ gefiltert. Im Vergleich mit der Connectivity-Map-Datenbank wurden der Fibrose entgegenwirkende Wirkstoffe identifiziert. Die Evaluierung eines potenziell erfolgversprechenden Wirkstoffs als Antifibrotikum wurde an hTF mittels indirekter Immunfluoreszenz in vitro durchgeführt.

Ergebnisse Die Analyse der Genexpressionsdaten führte zur Identifikation mehrerer in fibrotische Prozesse involvierter Interaktionsnetzwerke von Genen bzw. Proteinen. Eines dieser Netzwerke beinhaltet das Zytokin Bone morphogenic Protein 6 (BMP6) sowie Interleukin 6 (IL6) und Fibroblast Growth Factor 1 (FGF1). Ein weiteres relevantes Netzwerk konnte rund um das CD34-Gen (CD34: Cluster of Differentiation 34) identifiziert werden. Der Vergleich dieser Daten mit denen der Connectivity Map ermöglichte die Identifikation eines entsprechend invers wirkenden Wirkstoffs. Dessen Evaluierung im fibrotischen Zellkulturmodell in vitro mittels indirekter Immunfluoreszenz führte zu einer deutlichen Expressionsreduktion der fibrotischen Markerproteine Fibronektin und Alpha-smooth Muscle Actin (α-SMA), womit die vorhergesagte antifibrotische Wirkung bestätigt werden konnte.

Schlussfolgerung Systembiologische Ansätze können für die Identifikation von antifibrotischen Wirkstoffkandidaten zur Vermeidung postoperativer Fibrose genutzt werden und sollten sich über die Erfassung differenzieller Genexpressionsdaten weiterer okularer Zellen oder Gewebe auch auf andere ophthalmologische Anwendungsfelder transferieren lassen.

Abstract

Background The long-term success of fistulating therapies for the treatment of glaucoma is essentially limited by excessive scarring reactions (fibrosis). Cytostatic agents such as mitomycin C can prevent fibrosis, but are often associated with side effects. Specific antifibrotics are not currently in clinical use. Therefore, this study describes a systems biology approach using a dedicated bioinformatics technology platform, with which active substances can be identified and repositioned as antifibrotics.

Materials and Methods Differential gene expression data of human Tenon fibroblasts (hTF) were collected from untreated hTF and from hTF stimulated with TGF-β1 (“fibrotic fibroblasts”) by next-generation sequencing (NGS) and were used as the basis for the drug identification process. These data were filtered with the bioinformatic tool “FocusHeuristics”. In comparison with the Connectivity Map database, antifibrotic agents were identified. The evaluation of a potentially promising drug as an antifibrotic was performed at hTF by indirect immunofluorescence in vitro.

Results The analysis of the gene expression data led to the identification of several interaction networks of genes or proteins involved in fibrotic processes. One of these networks contains the cytokine bone morphogenic protein 6 (BMP6), interleukin 6 (IL6) and fibroblast growth factor 1 (FGF1). Another relevant network has been identified around the cluster of differentiation 34 (CD34) gene. The comparison of these data with those of the Connectivity Map allowed the identification of an inhibitory drug. Its evaluation in the fibrotic cell culture model in vitro using indirect immunofluorescence led to a significant reduction in the expression of the fibrotic marker proteins fibronectin and alpha-smooth muscle actin (α-SMA), which confirmed the predicted antifibrotic effect.

Conclusion Systems biological approaches can be used for the identification of antifibrotic drug candidates for the prevention of postoperative fibrosis and should be transferable by the investigating differential gene expression data of further ocular cells or tissues to other ophthalmological fields of application.

Schlüsselwörter

Glaukomchirurgie - Fibrose - Fibroblasten - Tenon - Antifibrotika

Key words

glaucoma surgery - fibrosis - fibroblasts - Tenon - antifibrotics

• Literatur

• 1 Baudouin C. Detrimental effect of preservatives in eyedrops: implications for the treatment of glaucoma. Acta Ophthalmol 2008; 86: 716-726 doi:10.1111/j.1755-3768.2008.01250.x
• 2 Droy-Lefaix MT, Bueno L, Caron P. et al. Ocular inflammation and corneal permeability alteration by benzalkonium chloride in rats: a protective effect of a myosin light chain kinase inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci 2013; 54: 2705-2710 doi:10.1167/iovs.12-10193
• 3 Sarkar J, Chaudhary S, Namavari A. et al. Corneal neurotoxicity due to topical benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci 2012; 53: 1792-1802 doi:10.1167/iovs.11-8775
• 4 Frech S, Kreft D, Guthoff RF. et al. Pharmacoepidemiological assessment of adherence and influencing co-factors among primary open-angle glaucoma patients – an observational cohort study. PLoS One 2018; 13: e0191185 doi:10.1371/journal.pone.0191185
• 5 Cairns JE. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. Am J Ophthalmol 1968; 66: 673-679 doi:10.1016/0002-9394(68)91288-9
• 6 Schmidt W, Schultze C, Stachs O. et al. Konzept eines druckgesteuerten Mikrostents für die Glaukomtherapie. Klin Monatsbl Augenheilkd 2010; 227: 946-952 doi:10.1055/s-0029-1245928
• 7 Hengerer FH, Auffarth GU, Riffel C. et al. Second-generation trabecular micro-bypass stents as standalone treatment for glaucoma: a 36-month prospective study. Adv Ther 2019; 36: 1606-1617 doi:10.1007/s12325-019-00984-9
• 8 Yamanaka O, Kitano-Izutani A, Tomoyose K. et al. Pathobiology of wound healing after glaucoma filtration surgery. BMC Ophthalmol 2015; 15 (Suppl. 01) S157 doi:10.1186/s12886-015-0134-8
• 9 Lockwood A, Brocchini S, Khaw PT. New developments in the pharmacological modulation of wound healing after glaucoma filtration surgery. Curr Opin Pharmacol 2013; 13: 65-71 doi:10.1016/j.coph.2012.10.008
• 10 Smith M, Charles R, Abdel-Hay A. et al. 1-year outcomes of the Xen45 glaucoma implant. Eye (Lond) 2019; 33: 761-766 doi:10.1038/s41433-018-0310-1
• 11 Hovakimyan M, Siewert S, Schmidt W. et al. Development of an experimental drug eluting suprachoroidal microstent as glaucoma drainage device. Transl Vis Sci Technol 2015; 4: 14 doi:10.1167/tvst.4.3.14
• 12 Mearza AA, Aslanides JM. Uses and complications of mitomycin C in ophthalmology. Expert Opin Drug Saf 2007; 6: 27-32 doi:10.1517/14740338.6.1.27
• 13 Verweij J, Pinedo HM. Mitomycin C: mechanism of action, usefulness and limitations. Anticancer Drugs 1990; 1: 5-13
• 14 Stahnke T, Löbler M, Kastner C. et al. Different fibroblast subpopulations of the eye: a therapeutic target to prevent postoperative fibrosis in glaucoma therapy. Exp Eye Res 2012; 100: 88-97 doi:10.1016/j.exer.2012.04.015
• 15 Park HY, Kim JH, Park CK. VEGF induces TGF-β1 expression and myofibroblast transformation after glaucoma surgery. Am J Pathol 2013; 182: 2147-2154 doi:10.1016/j.ajpath.2013.02.009
• 16 Stahnke T, Kowtharapu BS, Stachs O. et al. Suppression of TGF-β pathway by pirfenidone decreases extracellular matrix deposition in ocular fibroblasts in vitro. PLoS One 2017; 12: e0172592 doi:10.1371/journal.pone.0172592
• 17 Lamb J. The Connectivity Map: a new tool for biomedical research. Nat Rev Cancer 2007; 7: 54-60 doi:10.1038/nrc2044
• 18 Ernst M, Du Y, Warsow G. et al. FocusHeuristics – expression-data-driven network optimization and disease gene prediction. Sci Rep 2017; 7: 42638 doi:10.1038/srep42638
• 19 Gajda-Deryło B, Stahnke T, Struckmann S. et al. Comparison of cytokine/chemokine levels in aqueous humor of primary open-angle glaucoma patients with positive or negative outcome following trabeculectomy. Biosci Rep 2019; DOI: 10.1042/BSR20181894.
• 20 Andreev K, Zenkel M, Kruse F. et al. Expression of bone morphogenetic proteins (BMPs), their receptors, and activins in normal and scarred conjunctiva: role of BMP-6 and activin-A in conjunctival scarring?. Exp Eye Res 2006; 83: 1162-1170 doi:10.1016/j.exer.2006.06.003
• 21 Seong GJ, Hong S, Jung SA. et al. TGF-beta-induced interleukin-6 participates in transdifferentiation of human Tenonʼs fibroblasts to myofibroblasts. Mol Vis 2009; 15: 2123-2128
• 22 Yu-Wai-Man C, Owen N, Lees J. et al. Genome-wide RNA-Sequencing analysis identifies a distinct fibrosis gene signature in the conjunctiva after glaucoma surgery. Sci Rep 2017; 7: 5644 doi:10.1038/s41598-017-05780-5
• 23 Jiménez-Heffernan JA, Aguilera A, Aroeira LS. et al. Immunohistochemical characterization of fibroblast subpopulations in normal peritoneal tissue and in peritoneal dialysis-induced fibrosis. Virchows Arch 2004; 444: 247-256 doi:10.1007/s00428-003-0963-3
• 24 Hinz B, Phan SH, Thannickal VJ. et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. Am J Pathol 2007; 170: 1807-1816 doi:10.2353/ajpath.2007.070112
• 25 Tsai CC, Wu SB, Kau HC. et al. Essential role of connective tissue growth factor (CTGF) in transforming growth factor-β1 (TGF-β1)-induced myofibroblast transdifferentiation from Gravesʼ orbital fibroblasts. Sci Rep 2018; 8: 7276 doi:10.1038/s41598-018-25370-3
• 26 Park HH, Park IH, Cho JS. et al. The effect of macrolides on myofibroblast differentiation and collagen production in nasal polyp-derived fibroblasts. Am J Rhinol Allergy 2010; 24: 348-353 doi:10.2500/ajra.2010.24.3520
• 27 Kohyama T, Yamauchi Y, Takizawa H. et al. Clarithromycin inhibits fibroblast migration. Respir Med 2008; 102: 1769-1776 doi:10.1016/j.rmed.2008.06.020