A New Rapid Acetylcholinesterase Histochemical Method for the Intraoperative Diagnosis of Hirschsprung's Disease and Intestinal Neuronal Dysplasia

Summary

The most commonly used acetylcholinesterase (AChE) method for the diagnosis of Hirschsprung's disease (HD) and intestinal neuronal dysplasia (IND) was first introduced in 1964 by Morris Karnovsky and Logan Roots. This technique requires about 80 - 120 minutes incubation time and cannot be used for the intraoperative diagnosis of HD and IND. To avoid these limitations, in 1994 Kobayashi et al first proposed an accelerated modified method in two different versions, the first using diaminobenzydine (DAB) reagent, the second using 4-chloro-1-naphthol as final reagent. In the present study, we propose a new rapid variation of AChE staining which avoids the use of DAB and naphthol, notably toxic reagents, but follows the same acceleration principle of Kobayashi's technique. Our modified rapid AChE requires a total incubation time of only 8 minutes, which is compatible with intraoperative histochemical examination purposes.

Intraoperative seromuscular or full-thickness intestinal biopsies were obtained from 92 children affected by intestinal dysganglionoses. The biopsies were frozen and cut in 15 µm cryostatic sections. Rapid AChE was performed with a special incubation medium using 3-amino-9 ethylcarbazole (AEC) as chromogenic substance. The two complementary histochemical techniques alpha-naphthylesterase (ANE) and lactate-dehydrogenase (LDH) were also used intraoperatively for the staining of ganglion cells. The diagnosis was confirmed postoperatively with conventional AChE Karnovsky technique, comparing the extensions of hyperganglionic, hypoganglionic and aganglionic segments in each studied case.

The new rapid AChE modified method can identify ganglion cells and fibers using a dark brown precipitate. In all the cases studied, the intestinal innervation pattern identified with this modified technique was similar to that obtained with Karnovsky AchE. Seventy-eight HD, 8 isolated IND and 6 HD associated with an evident IND segment were diagnosed.

This new rapid AChE histochemical technique avoids the use of DAB and naphthol, and can thus be considered safe for operators. Rapid AChE is a valid tool for both the evaluation of aganglionosis extension and for the identification of IND pattern during surgery. We recommend this very reliable method for the intraoperative diagnosis of HD and IND, in association with other enzymatic markers of ganglion cells (ANE or LDH). We propose the following diagnostic protocols: a) for preoperative histochemical study: conventional AChE plus LDH and NADPH-diaphorase; b) for intraoperative study: rapid AChE plus ANE.

Résumé

Très fréquemment, la méthode par l'acétylcholinesterase (AchE) est utilisée pour le diagnostic de la maladie de Hirschsprung (HD) et les dysplasies intestinales neuronales (IND). Cette technique a d'abord été introduite en 1964 par Morris Karnovsky et Logan Roots. Cette technique nécessite environ 80 à 100 minutes d'incubation et ne peut pas être utilisée pour le diagnostic per-opératoire de HD et de IND. Pour éviter ces limitations, en 1994 Kobayashi et collaborateurs proposèrent d'abord une méthode accélérée modifiée dans deux différentes versions, la première utilisant la diaminobenzydine (DAB), la seconde utilisant le 4-chloro-1-naphtol comme réactif. Dans la présente étude, nous proposons une nouvelle variation de la coloration par l'acétylcholinesterase qui évite l'utilisation de DAB et de naphtol, mais qui entraîne la même accélération que la technique de Kobayashi. Notre méthode modifiée AchE nécessite une incubation totale de 8 minutes seulement, qui est compatible avec son utilisation en per-opératoire.

Des biopsies per-opératoires séro-musculaires ou épaisses de l'intestin étaient obtenues chez 92 enfants atteints de dysganglionoses intestinales. Les biopsies étaient congelées et coupées en sections de 15 µm. La technique rapide AchE était réalisée avec une incubation utilisant le 3-amino-9 éthylcarbazole (AEC) comme substance chromogène. Deux techniques histochimiques complémentaires alpha-naphthylesterase (ANE) et lactate-dehydrogénase (LDH) étaient aussi utilisées en per-opératoire pour la coloration des cellules ganglionnaires. Le diagnostic était confirmé en post-opératoire avec une AchE conventionnelle. Nous comparons l'extension des segments hyperganglionnaires, hypoganglionnaires, et aganglionnaires dans chaque cas étudié.

La nouvelle méthode AchE rapide modifiée peut identifier des cellules ganglionnaires et des fibres en utilisant un précipité brun foncé. Dans tous les cas étudiés, l'aspect de l'innervation intestinale identifiée avec cette technique modifiée était similaire à celle obtenue avec la technique Karnovsky AchE. Soixante dix-huit HD, 8 IND isolées et 6 HD associées avec un segment de IND étaient diagnostiquées. Cette nouvelle technique histochimique rapide AchE évite l'utilisation de DAB et de naphtol et peut alors être considérée comme sûre pour les techniciens.

La méthode rapide AchE est un outil efficace pour à la fois l'évaluation de l'extension aganglionnaire et pour l'identification des IND durant l'acte chirurgical. Nous recommandons cette méthode très sûre pour le diagnostique intra-opératoire de HD et de IND en association avec d'autres marqueurs enzymatiques des cellules ganglionnaires (ANE ou LDH). Nous proposons le protocole diagnostique suivant: a) pour une étude histochimique pré-opératoire: AchE conventionnelle plus LDH et NADPH-diaphorase; b) pour l'étude intra-opératoire: ACHe rapide plus ANE.

Resumen

El método más ampliamente usado para el diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung (HD) y de la displasia neuronal intestinal (IND) es el de la acetilcolinesterasa (ACHe) introducido inicialmente en 1964 por Karnovsky y Roots. Esta técnica requiere unos 80 a 120 minutos de incubación y no puede, por lo tanto, ser usada para el diagnóstico intraoperatorio de HD e IND. Para evitar estas limitaciones Kobayashi y colaboradores, propusieron en 1994 un método acelerado modificado en dos versiones diferentes: la primera usaba diaminobencidina (DAB) y la segunda 4-cloro-1-naftol como reactivos.

En el presente estudio proponemos una nueva variación rápida de la tinción ACHe que evita el uso de DAB y naftol que son notablemente tóxicos pero que sigue el mismo principio de aceleración que la técnica de Kobayashi. Nuestra técnica rápida modificada ACHe requiere un tiempo total de incubación de sólo 8 minutos que es compatible con el examen histoquímico intraoperatorio.

Obtuvimos biopsias intraoperatorias seromusculares o de pared total de 92 niños con disganglionosis intestinal. Las biopsias se congelaron y se cortaron a 15 µm. Se realizó la prueba rápida de ACHE con un medio de incubación especial usando 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como sustancia cromogénica. También usamos las dos técnicas histoquímicas complementarias alfa-naftil-esterasa (ANE) y lactato-deshidrogenasa (LDH) intraoperatoriamente para teñir las células ganglionares. El diagnóstico se confirmó postoperatoriamente con técnica convencional de ACHe de Karnovsky comparando las extensiones de los segmentos hipergangliónico, hipogangliónico y agangliónico en cada caso.

La nueva técnica rápida de ACHe puede identificar las células ganglionares y las fibras mediante un precipitado pardo oscuro. En todos los casos estudiados la inervación intestinal se identificó con esta técnica modificada de forma similar a como se hace con la técnica convencional de Karnovsky. Fueron así diagnosticadas 78 HD, 8 IND aisladas y 6 HD asociadas con IND.

Esta nueva técnica histoquímica rápida de ACHe evita el uso de DAB y naftol y puede ser considerada como más segura para los técnicos.

Zusammenfassung

Die weit verbreitete Acetylcholinesterase-Färbung in der Diagnose des Morbus Hirschsprung und der intestinalen neuronalen Dysplasie wurde zuerst 1964 von Morris Karnovsky und Logan Roots beschrieben. Diese Technik benötigt eine Inkubationszeit von ca. 80 - 120 Minuten und kann deshalb für die intraoperative Diagnostik eines Morbus Hirschsprung oder einer IND nicht angewendet werden. Um diese zeitliche Limitierung zu vermeiden, schlug Kobayashi als erster 1994 einen Schnelltest vor. Dabei propagierte er zwei Versionen: Eine Technik, die Diaminobenzydine (DAB) verwendet, eine zweite, bei der 4-Chloro-1-Naphthol als abschließendes Reagenz verwandt wird. In der vorliegenden Studie wird ein neuer Acetylcholinesterase-Schnelltest vorgeschlagen, bei dem sowohl DAB wie Naphthol wegen ihrer hohen Toxizität vermieden werden. Dennoch folgt der Test den Prinzipien der Technik von Kobayashi. Die modifizierte Technik der Acetylcholinesterase-Färbung erfordert eine Gesamtinkubationszeit von nur 8 Minuten, was eine Verwendung des Tests im Rahmen einer Schnellschnittuntersuchung erlaubt.

Von 92 Kindern mit IND wurden intraoperativ serummuskuläre Ganzwandbiopsien entnommen. Die Biopsien wurden gefroren und im Kryostaten in 15 µm-Schnitten aufgeteilt. Der Acetylcholinesterase-Schnelltest wurde innerhalb der verkürzten Inkubationszeit in einem Medium aus 3-Amino-9 Ethylcarbazole (AEC) als chromogene Substanz durchgeführt. Um die Ganglienzellen zu färben, wurden die histochemischen Techniken der Alphanaphthylesterase- (ANE) und Lactatdehydrogenase-Färbung komplementär durchgeführt. Postoperativ wurde die Diagnose mit der konventionellen Acetylcholinesterase-Färbetechnik nach Karnovsky überprüft und insbesondere die Ausdehnung von hyperganglionären, hypoganglionären und aganglionären Segmenten in jedem individuellen Fall mit der Schnellschnittuntersuchung verglichen.

Der neue Acetylcholinesterase-Schnelltest erlaubt eine Identifizierung der Ganglienzellen und der parasympathischen Nervenfasern, die sich als dunkle braune Präzipitate darstellen. In allen untersuchten Fällen entsprach das mit dem Schnelltest untersuchte Innervationsmuster dem der späteren Karnovsky-Färbung. 78 Patienten mit Morbus Hirschsprung, 8 mit isolierter IND und 6 mit einer Kombination von Morbus Hirschsprung und IND wurden diagnostiziert.

Schlussfolgerung: Der neue Acetylcholinesterase-Schnelltest erlaubt die Vermeidung des toxischen Diaminobenzydins oder Naphthols und ist daher sicher für den Operateur und den Pathologen. Die Acetylcholinesterase-Schnellfärbung erlaubt sowohl das Ausmaß der Aganglionose wie die Identifizierung dysganglionärer Veränderungen während des Eingriffes. Der Schnelltest wird daher als verlässliche Methode zur Diagnose des Morbus Hirschsprung und der neuronalen intestinalen Dysplasie empfohlen, wobei jedoch postoperativ auch andere enzymatische Marker wie ANE oder LDH verwandt werden sollten. Im Einzelnen wird empfohlen, präoperativ eine histochemische Untersuchung mit konventioneller Acetylcholinesterase-Färbung, LDH-Färbung und NADPH-Diaphorasefärbung durchzuführen und intraoperativ einen Acetylcholinesterase-Schnelltest plus ANE vorzunehmen.

Key words

Hirschsprung's disease - Intestinal neuronal dysplasia - Acetylcholinesterase - Histochemistry - Enteric nervous system

Mots-clés

Maladie de Hirschsprung - Dysplasie neuronale intestinale - Acetylcholinesterase - Histochimie - Système neuro-entérique

Palabras clave

Enfermedad de Hirschsprung - Diplasia neuronal intestinal - Acetilcolinesterasa - Histología

Schlüsselwörter

Hirschsprung-Krankheit - IND - Acetylcholinesterase - Histochemie - enterales Nervensystem

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