Perspectives of Clinical Application of Bone Morphogenetic Proteins in Children

Abstract

The purpose of the study was to modify the method of Bone Morphogenetic Protein (BMP) extraction from bovine bones, estimate the osteoinductive potential of the extracted protein fractions in relation to the degree of protein purity and to test collagen formed in porous discs as a carrier. It was required before BMP application in reconstructive surgery in children.

Material and Method

BMP preparation from bovine bones was conducted according to a modification of Luyten's method. Three fractions of different degree of purity - demineralised bone matrix “M”, extract “E”, and fraction after hydroxyapatite column “HP” - were tested for their osteoinductive potential. They were implanted on a collagen carrier into the right rat femoral muscle pouch. Controls were implanted in the same way in the left muscle pouch. The discs were removed after 3 and 6 weeks and tested for alkaline phosphatase activity, a marker of new bone formation.

Results

Out of the 10 animals used for testing the osteoinductive potential of matrix fraction, 7 results were positive and 3 negative. In the case of the extract fraction, the analysis was conducted for 3 weeks on 9 rats and 6 weeks on 13 rats. Six and 11 positive results were obtained, respectively. In the HP group 5 animals were observed for 3 weeks (3 positive, 2 negative) and 10 animals for 6 weeks (7 positive, 3 negative). In the case of the extract, the differences in alkaline phosphatase activity after 6 weeks were statistically significant (p ≤ 0.05) compared to controls. In the other groups, a positive tendency was observed, but it was not statistically significant.

Conclusions

Purified BMP has osteoinductive abilities causing ectopic new bone formation. From all obtained BMP fractions the extract had the highest osteoinductive potential and seems to be an optimal fraction for further clinical use. These results offer hope for a prompt clinical application of nonantigenic, xenogenic BMP, especially in three-dimensional bone reconstruction, for the treatment of non-united fractures or fractures with delayed union, to fill either bone cysts or other defects.

Résumé

Le but de cette étude est de modifier la méthode d'extraction de BMP (Bone Morphogenetic Protein) des os de bovins et une détection d'ostéo-inductivité potentielle de cette protéine. L'extraction a été réalisée selon la méthode de Luyten modifiée. On a identifié 3 fractions différentes: matrice d'os déminéralisé (M), extrait (E) et une fraction après un passage sur les colonnes d'hydroxy-apathite (HP). L'ostéoinductivité de chaque fraction a été testée par implantation dans le muscle fémoral droit du rat. Les contrôles ont été faits dans les muscles fémoraux gauches. Les disques implantés ont été enlevés après 3 et 6 semaines.

Résultats

Parmi 10 rats testés avec M, le résultat a été positif chez 7. Chez les rats testés avec E, les résultats positifs ont été observés chez 6 des 9 rats après 3 semaines, et chez 13 rats sur 13 après 6 semaines. Chez les rats traités avec HP, 3 sur 5 ont été positifs après 3 semaines et 7 sur 10 après 6 semaines. La différence d'activité de phosphatase alcaline a été significative (p < 0.05). Le BMP a un potentiel ostéo-inductif plus important dans la fraction E. Les résultats permettent d'avoir un espoir d'application clinique de E/BMP dans les cas de retard de consolidation, de traitement des kystes, de reconstruction post-traumatique et post-chirurgicale.

Resumen

El objetivo de este estudio es modificar el método de extracción de proteínas óseas morfogénicas (BMP) de huesos bovinos, estimar el potencial osteoinductivo de las fracciones proteícas extraídas en relación con el grado de pureza proteíca y probar el colágeno formado en discos porosos portadores. Esto fue considerado necesario antes de aplicar BMP en la cirugía reconstructiva de niños.

Material y Metodos

La preparación de BMP a partir de huesos bovinos se llevó a cabo con el método de Luyten. Se hallaron 3 fracciones con diferente grado de pureza: matriz ósea desmineralizada (M), extracto „E“, fracción tras columna de hidroxiapatita „HP“ y se probaron para determinar su potencial osteoinductivo. Se implantaron en el portador de colágeno en una bolsa muscular femoral en ratas. Los controles se pusieron en el miembro opuesto. Los discos se extrajeron a las 3 - 6 semanas y se determinó la actividad de fosfatasa alcalina, un marcador de nueva formación ósea.

Resultados

De 10 animales usados para probar el potencial osteoinductor de la fracción proteica 7 tuvieron resultados positivos y 3 negativos. En el caso de la fracción extraída se llevo a cabo la observación de 3 durante 3 semanas en 9 ratas y durante 6 semanas en 13. Se obtuvieron 6 y 11 resultados positivos respectivamente. En el grupo HP se observaron 5 animales durante 3 semanas (3 positivos y 2 negativos) y 10 animales durante 6 semanas (7 positivos y 3 negativos). En el caso del extracto las diferencias en la actividad de fosfatasa alcalina tras 6 semanas fueron estadísticamente significativas en comparación con los controles. En los demás grupos se observó una tendencia positiva sin resultados estadísticamente significativos.

Conclusiones

La BMP purificada tiene capacidad osteoinductiva que origina formación ectópica de nuevo hueso. De todas las fracciones de BMP obtenidas, el extracto tenía mayor potencial osteoinductor y parece ser una fracción óptima para el uso clínico. Estos resultados son esperanzadores sobre la aplicación clínica cercana de BMP no antigénico xenogénico especialemente en reconstrucción tridimensional ósea en casos de fracturas no consolidadas o con consolidación retardada así como para rellenar quistes óseos o otros defectos.

Zusammenfassung

Zielsetzung

Ziel der Untersuchung war es, die Methode der Extraktion des BMP (Bone Morphogenetic Protein) aus Rinderknochen zu entwickeln, die osteoinduktive Wirkung des extrahierten Proteins je nach Stufe der Reinheit des Proteins zu prüfen und die Anwendbarkeit von Versuchskollagen als poröser Carrier zu testen. Die experimentelle Untersuchung der Tiere war nötig, bevor Bone-Morphogenetic-Protein bei Kindern angewandt werden konnte.

Material und Methodik

Die Präparation des BMP aus Rinderknochen wurde nach der Luyten-Methode durchgeführt. Dabei wurden drei verschiedene Reinheitsstufen definiert: Demineralisierte Knochenmatrix „M“, ein Extrakt „E“ und eine Fraktion nach Hydroxyapatit-Säule „HP“. Alle drei Fraktionen wurden auf ihr osteoinduktives Potenzial getestet. Die Proteine wurden auf Kollagenträger aufgebracht und in den Oberschenkelmuskel einer Ratte implantiert. Kontrollproben wurden in die kontralaterale Extremität eingebracht. Die Carrier wurden nach 3 - 6 Wochen entfernt und die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Marker für die Knochenneubildung überprüft.

Ergebnisse

7 von 10 Tieren der Gruppe demineralisierter Knochenmatrix (M) zeigten ein positives osteoinduktives Potenzial, 3 waren negativ. Bei der Extraktgruppe wurden 9 Ratten 3 Wochen lang und 13 Ratten 6 Wochen lang beobachtet. 6, respektive 11, zeigten eine positive osteoinduktive Wirkung des Carriers. In der HP-Gruppe wurden 5 Tiere 3 Wochen lang (3 positiv, 2 negativ) und 10 Tiere 6 Wochen lang (7 positiv, 3 negativ) beobachtet. Bei der Extraktgruppe waren die Serumspiegel der alkalischen Phosphatase nach 6 Wochen statistisch signifikant unterschiedlich (p ≤ 0,05) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bei den übrigen Gruppierungen fanden sich keine statistischen Unterschiede.

Schlussfolgerungen

Gereinigtes Bone-Morphogenetic-Protein hat eine osteoinduktive Fähigkeit, die an ektopen Körperstellen neuen Knochen bilden kann. Von allen untersuchten BMP-Fraktionen zeigte der Extrakt die höchste osteoinduktive Wirkung und scheint daher am geeignetsten für den klinischen Gebrauch. Diese Ergebnisse berechtigen zur Hoffnung, dass eine klinische Anwendung von nichtantigenem, xenogenem BMP, insbesondere bei der dreidimensionalen Knochenrekonstruktion z. B. bei Pseudarthrosen, verzögerter Bruchheilung, Knochenzysten oder anderen Defekten angewandt werden kann.

Key words

BMP - Ectopic osteogenesis

Mots-clés

BMP - Ostéogenèse ectopique

Palabras clave

BMP - Osteogénesis ectópica

Schlüsselwörter

Osteogenese - Morphogenetisches Knochenprotein - Osteoinduktive Wirkung - Knochenzysten - Pseudarthrose

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